葡聚糖蔗糖酶的研究进展_黄华波

湖南农业科学2013，（07）：12~15Hunan Agricultural Sciences

葡聚糖蔗糖酶的研究进展

黄华波1，谭周进2

（1. 湖南农业大学生物安全科学技术学院，湖南长沙410128；

2. 湖南中医药大学医学院，湖南长沙410208）

摘

要：葡聚糖蔗糖酶（Glucansucrase ）是一类α-转糖苷酶，是生物催化合成中一种重要的工具酶。对葡聚糖蔗糖酶

（Glucansucrase ）类型与转糖基反应机制，及其在生物催化合成中的应用、蛋白质工程改造等方面的作用进行了综述。

关键词：葡聚糖蔗糖酶；转糖基作用；外源受体；低聚糖；酶工程；综述中图分类号：TS201.23

文献标识码：A

文章编号：1006-060X （2013）07-0012-04

Advances in Glucansucrase

HUANG Hua-bo 1, TAN Zhou-jin 2

(1.College of Bio-safety Science &Technology, HNAU, Changsha 410128, PRC; 2. College of Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, PRC)

Abstract:Glucansucrase is a kind of α-transglucosidase, and also is an important tool enzyme for biocatalysis and

biosynthesis. The types and the transglycosylation mechanism of glucansucrase as well as its application in biocatalysis, biosynthesis and role in protein engineering were reviewed.

Key words:glucansucrase; transglycosylation; exogenous acceptor; oligosaccharides; enzyme engineering; review 葡聚糖蔗糖酶（Glucansucrase ）是一类α-转糖

苷酶，能以蔗糖为受体底物，在无其它物质参与反应时生成α-葡聚糖，当有可识别的外源受体存在时，也能将葡糖基转移给外源受体而生产各种糖基化产物。因葡聚糖蔗糖酶反应的特异性、产物的多样性以及对于产物合成的可操作性而使其成为生物催化合成中一种重要的工具酶。在饲料、食品、医药等工业领域有着广泛的应用前景。

6键连接的多聚糖称为Dextrans 等。主要以α-1，

（右旋糖苷），生产此类的酶称为Dextransucrases （右旋糖酐蔗糖酶DSR ），主要发现在明串珠球菌属；Mutansucrases 主要分离自链球菌属，合成α-1，3键型葡聚糖，称为Mutan ，通过加强链球菌在牙齿表面的定植和吸附而在龋齿的形成中扮演重要角色；Reuteransucrases ，主要发现在乳酸菌属，产生4和α-1，6键；Alternansucras －葡聚糖主要是α-1，

es ，主要由明串珠球菌属产生，合成非典型的α-1，3与α-1，6交替的葡聚糖，称为Alternan ；Amy －losucrases （淀粉蔗糖酶），来自于GH13家族，主要发现于奈瑟氏菌属、异常球菌属和交替单胞菌属，产生一个由α-1，4键构成的与淀粉高度相似的多聚糖[2-4]。

葡聚糖蔗糖酶可由不同的菌种产生，这些菌属包括：明串珠菌属、乳酸菌属、魏斯氏菌属、链球菌属、异常球菌属、奈瑟氏菌属、交替单胞菌属、假单胞菌属和双歧杆菌属。

1葡聚糖蔗糖酶的种类与特性

通常蔗糖转糖苷酶（Sucrose-utilizing transglu －

[1]

cosidases ）可以分为糖苷水解酶70和13两个家族，

除淀粉蔗糖酶（Amylosucrases ）属于GH13家族外，大多数葡聚糖蔗糖酶都属于GH70家族，淀粉蔗糖酶主要是一类酶促转化合成淀粉的催化剂。它并非降解淀粉，而是将蔗糖合成与淀粉类似的多聚糖。葡聚糖蔗糖酶的主要反应是产生胞外多聚糖，这些α-葡聚糖以不同类型的糖苷键相连，他们的结构和分子量大小是由酶的特异性和产酶菌株决定的。根据产生不同多聚糖的类型，葡聚糖蔗糖酶可以分为5类，这些不同的多聚糖特征一是分子量达到106以上，另一个是D-葡糖基单位以不同的共价键连接，如α-1，6、α-1，3、α-1，4、α-1，2糖苷键

收稿日期：2013-03-01

作者简介：黄华波（1981-），男，湖南岳阳市人，硕士研究生，

研究方向为微生物酶。

2酶的催化反应机制与结构分析

在酶促低聚糖的合成途径中，葡聚糖蔗糖酶不

需要添加糖核苷酸或1-磷酸葡萄糖，仅以蔗糖的分解供能就能合成需要的糖苷，在经济上具有无可比拟的优势。一般来说，主要的催化反应包含2个步骤。第一步（葡萄糖基步骤），亲核残基表现出对糖基环变旋异构效应的碳原子进行亲核攻击，并且

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同时，催化酸（谷氨酸）使蔗糖供体配糖体的氧原子

质子化。这就导致了一个β-D-葡糖基酶共价中间体的形成和果糖的释放；第二步（去葡萄糖基步骤），通过去质子化的羧酸基团攻击糖苷环异头C1原子与天冬氨酸之间的共价键而将葡糖基分子转移给活性受体[5]。除了生成低聚糖外，通过葡糖基复合体构造的逆反应还能产生蔗糖同分异构体。

来源不同的葡聚糖蔗糖酶结构上都具有高度的相似性，比如GH13家族和GH70家族的酶体系

[6]

构架采取（β/α）是由8个平行的β折8管状结构，

叠形成的内部β管被8个α螺旋围绕所形成，因此单个的α螺旋和β折叠相互交替并以环形连结。然而两者活性中心的拓扑结构也显示了明显的差异。在20世纪90年代，人们就已经克隆出葡聚糖蔗糖酶GTF-I 全基因片段，并在体外成功表达出高纯度的GTF-I ，从而也对该酶的蛋白质结构做出了预测。直到2008年，Dijkstra 等才成功的捕捉到GTF180葡聚糖蔗糖酶的晶体结构，从而也证实更早对于（β/α）2011年，日本静8管状结构的预测。冈县立大学、东京大学等联合机构首先通过人工方法大量制造出来自于口腔链球菌的葡聚糖蔗糖酶GTF-SI ，随后使其结晶，并通过X 射线进行分析，首次弄清楚了导致龋病的葡聚糖蔗糖酶的立体结构，研究发现，尽管该酶与α-淀粉酶结构类似，但它存在淀粉酶中并没有的螺旋结构部分，推测就是这些部分参与了葡聚糖的制造[7]。

要益生元成分。DSR-E 是来自于肠明串珠菌NR －RL B-1299的一种葡萄聚糖蔗糖酶，合成一种包含29%α-1，2糖苷键的葡萄聚糖，当用麦芽糖作受体时，这种特异性得到维持，结果产生一系列在非

2糖苷键的低聚糖，还原末端包含或不包含α-1，

这种低聚半乳糖不能被人和动物的消化酶所消化，

以动物模型进行的研究显示，他们能够被来自于人肠道微生物区系的细菌所代谢，因此被应用于皮肤美容中用于维持皮肤微生物区系的平衡[13]。

除了麦芽糖和异麦芽糖，来自明串珠菌属葡聚糖产生菌NRRL B21297的交替蔗糖酶被发现能以龙胆二糖作为底物合成糖基化龙胆二糖，是一种潜在的益生元，而且没有龙胆二糖的苦味[14]。更有趣的是，葡聚糖蔗糖酶还可以利用许多外源的底物来合成不同的糖苷，这些底物包含糖类（半乳糖、木糖、鼠李糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺），芳香族物质（儿茶素、木犀草素、槲皮苷、杨梅酮），醇类（邻羟基苯甲醇、不同链长的主要醇类）和氨基酸衍生物等[15-17]。

2000年Hartmans 等[18]系统研究了变形链球菌GS-5株GTF-D 非糖基受体特异性和反应条件的优化。结果表明，二羟基芳香烃化合物如邻苯二酚、4-甲基邻苯二酚和3-甲氧基邻苯二酚都能够被GTF-D 高效的转糖基，当糖受体浓度为40mmol/L，且以200mmol/L蔗糖作为糖供体反应时，以上化合物糖基化产率分别为65%、50%和75%。3-甲氧基间苯二酚也能够被转糖基，但效率极低，许多其它的芳香族化合物如苯酚、间羟基苯甲醛、间苯二酚等不能够被GTF-D 转糖基。因此可以推断GTF-D 芳香族受体需要2个相邻的羟基基团。同时还研究了各种亲水性的有机化合物作为助溶剂以促进难溶于水的糖受体的转糖基作用。选择黄酮类儿茶素作为一个模式受体，二乙二醇二甲醚（MEE ）作为可用的助溶剂。当反应体系中添加15%MEE 时，黄酮类儿茶素转糖基效率提高4倍，其水中溶解度提高12倍，10%～30%的MEE 同时也能够用于儿茶酚、4-甲基邻苯二酚、3-甲氧基邻苯二酚的转糖基反应中，但过高的受体浓度有时候能够使酶失活而抑制反应。

3葡聚糖蔗糖酶的外源受体反应

除了体系中只存在蔗糖的反应外，当一个羟基

一个酒精、一个多元醇或者一个化受体，如一个糖、黄酮类物质加入到反应混合物中，葡聚糖蔗糖酶的催化活性能够从天然反应重新定向为为这些外源

受体转糖基，如果这些受体能够被酶很好的识别的话[8]。研究显示，一些受体物质被糖基化后，其稳定性、溶解性或生物利用度等显著增加[9-12]。

从20世纪50年代开始，人们就知道葡聚糖蔗糖酶能够催化外源受体发生转糖基反应。短的葡糖基低聚糖通过二糖的延伸而形成，这些二糖有麦芽糖、异麦芽糖、黑曲霉糖和龙胆二糖。葡糖基化反应产率与酶对受体分子的识别和反应条件有关。工业上，DSR-S 利用外源底物合成一系列与低聚麦芽糖类似的低聚半乳糖，和工业生产从淀粉降解得到的低聚麦芽糖酶促转糖基产生的低聚麦芽糖苷有结构的类似性，这些产物是日本市场上出现的主

4酶工程改造与方法

当天然的葡聚糖蔗糖酶用于大规模的工业合

成来生产各种低聚糖或糖基化产物时，往往会因为酶的底物特异性、稳定性或催化效率等因素而受到

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限制。为了克服这些限制因素扩充酶的工业应用，近年来发展的蛋白质工程方法能对酶的催化特性进行改造而提供了一种全新的手段。人们期望酶可以高效的合成设定的产物，并且尽量减少副反应。酶工程策略也叫定向进化，是基于通过随机突变或重组建立突变体文库，并用合适的方法进行选择，最终得到功能改进的酶。这些方法的优势是不需要弄清楚酶的三维结构，就能够显著的检测到酶对特定底物的活性和其它的特性如溶解度和热稳定性等的提高。

Vander Veen 等[19]采用易错PCR 进行基因重组并通过选择性筛选能够从多糖奈瑟菌中产生更高效的、差异性的淀粉蔗糖酶。从突变体文库使用只含有蔗糖作为唯一碳源的固体培养基来筛选得到具有淀粉蔗糖酶活性的克隆。结果表明，其中最好的分离酶种N387D 催化效率提高了3倍，另一个改进的酶E227G 相对于野生型酶能够合成更长的淀粉链。这个小组还从一个含有60000个克隆的突变体文库中，筛选出3株淀粉蔗糖酶的重组酶（2株双突变和1个单突变），显示他们在50℃的热稳定性相对于野生型提高了3.5～10倍。半衰期活性最好的突变株在50℃能够保持32min ，而野生型在这个温度3min 内几乎全部降解。在50℃，用改进的突变体和高浓度蔗糖合成淀粉，相比在30℃的原酶能够得到原来2倍的淀粉链长度[20]。来自于GH70家族的葡聚糖蔗糖酶的转糖基活性也被定向进化而得到提高了。用超软X 射线照射肠膜明串珠菌B-742CB 葡聚糖蔗糖酶基因，产生的葡聚糖蔗糖酶催化活性提高2.3倍，并且目前酶合成更多重分枝的α-1，3糖苷键的多聚糖[21]。

来源于肠膜明串珠菌NRRL B-1299的葡聚糖蔗糖酶DSR-E ，天然以α-1，6和α-1，2糖苷键合成，通过改造后得到的一个突变株能仅以α-1，2糖苷键合成[22]。使用一个半理性的改造方法，对来自于链球菌的GTF-R 靠近过度稳定区域的2个氨基酸位点进行修饰，最终该酶的催化特异性从α-1，6键转为α-1，3键，同时它的转糖基效率和活性都得到保留。野生型GTF-R 主要合成α-1，6糖苷键（超过62%）产物，而突变体则主要以α-1，3糖苷键（超过46%）合成葡聚糖多聚物[23]。有时候通过改变葡聚糖蔗糖酶其中的一个氨基酸，它就能从合成多聚糖改为合成低聚糖。从肠膜明串珠菌NR －RL B-512F 产生的DSR-S 和DSR-T5首先对受体结构域进行突变，然后将2个酶重组得到单个酶突

变体GS ，可以产生与父母代合成的结构有差异的

葡聚糖。试验表明，重组酶能够产生包含α-1，6、α-1，3和α-1，4键的水溶性葡聚糖[24]。

5总结与展望

上述研究表明，通过葡聚糖蔗糖酶的天然反

应，可以用可再生原料来生产各种不同类型的葡聚葡糖基低聚糖和葡糖基衍生物。目前已经能够糖、

把葡聚糖蔗糖酶结构与功能关系的研究与蛋白质工程技术的发展相结合，从而使它的功能和应用得到极大的提高。新的葡聚糖蔗糖酶能够发生自然界不存在的与之等价的酶所催化的反应以及表现出新的特征，从而人们利用这个催化工具来生产更多的生物活性糖苷（例如抗生素、激素、甜味素、生物碱、黄酮类等）。这种巨大的潜能甚至能够让人们设想葡聚糖蔗糖酶β-糖苷键产物的出现。采用何种方法来扩充葡聚糖蔗糖酶在生物合成中的应用？又将遵循什么样的指导方法来完成这个目标呢？首先，要想更深入在分子水平了解葡聚糖蔗糖酶的特性，将需要得到酶的大量的三维立体结构信息，必须在能够为工程酶的理性设计提供更多必要信息方面做最大的努力。然而，酶工程策略的成功也很大程度上依赖于有效的检测方法的设计，从而从大量的文库中分离出需要的突变体。这就意味着需要设计更多自动化的和敏感的检测实验方法。另一个具有挑战性的方面是对于酶工程的快速、预测性设计缺少必要的酶系统动力学信息。对于酶结构和动力学方面突变效应的预测仍是一个难题。分子动力学、蛋白质模拟以及底物动力学相结合的生物物理技术构象变化的应用依然受困。多学科综合无疑将促进这个领域的重大发展，计算机技术在提高酶的重组效率方面扮演重要角色，新技术的应用将提高酶的表达、效率、稳定性和专一性，也就是说，改造出理想的葡聚糖蔗糖酶为更好的生物催化所利用。

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（责任编辑：高国赋）