生姜蛋白酶的提取纯化工艺研究

生姜蛋白酶的提取纯化工艺研究

学生姓名： 指导教师：

摘要：本文通过比较研究生姜蛋白酶的提取纯化工艺，采用丙酮沉淀法对生姜蛋白酶进行初步纯化后，通过双水相萃取，反胶束萃取对生姜蛋白酶进行进一步纯化比较，分析了在双水萃取中聚乙二醇分子量，聚乙二醇浓度，硫酸铵浓度、酸盐浓度，磷酸盐缓冲液pH对萃取效果的影响。对反胶束萃取中KCl浓度以及W0值对萃取效果的影响。

关键词：生姜蛋白酶；有机溶剂沉淀法；硫酸铵盐析法；双水相萃取；反胶束萃取

Research on extraction and purification of Ginger protease

Student: YANG Teacher:

Abstract: This article through the comparative study of ginger protease extraction and purification technology, using acetone precipitation of ginger protease for preliminary purification, through the two phasepartitioning, reversedmicelle of ginger protease for further purification comparison, analyzes the dual water extraction in the molecular weight polyethylene glycol (peg), polyethylene glycol (peg) concentration, ammonium sulfate concentration, acid salt concentration, phosphate buffer to the effects of the pH extraction. To reverse micelle concentration in the extraction of W0 value and KCl extraction effect.

Key words: Ginger protease; organic solvent extraction; ammonium sulfate salting-out; aqueous two-phase extraction; anti-micelle extraction

前 言

生姜蛋白酶是在继木瓜蛋白酶等以后发现的一种新的植物蛋白酶，它在结构与性质上与木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及无花果蛋白酶等具有很多的相似性，被认为是木瓜蛋白酶家族的又一新成员。生姜蛋白酶在肉类嫩化、酒类澄清以及凝乳中均具有广泛的应用前景，开发潜力较大。生姜蛋白酶用于肉类嫩化，不仅可以显著提高肉的嫩度，而且可以使其具有良好的风味[1]。生姜蛋白酶用于酒类澄清，可显著提高啤酒和葡萄酒的澄清度。我国传统食品“姜撞奶”用姜汁作为凝乳剂，其中的凝乳因子被证明就是生姜蛋白酶。[2]

开展生姜蛋白酶的研究将会为其在食品领域的应用提供理论依据, 改变我国植物蛋白酶资源长期以来主要依赖于木瓜、菠萝等少数热带水果资源的现状, 对于稳定生姜种植面积, 保证生姜产业持续高效发展, 扩大生姜资源的利用途径, 调节农业产业结构均具有重要意义,对于进一步丰富生姜蛋白酶的酶学性质和以生姜为原料开发新型的营养保健制品也具有积极的作用和指导意义。

生姜蛋白酶目前广泛采用的提取方法主要有沉淀法和超滤法两大类，通常采用的沉淀剂主要是有机溶剂如丙酮和乙醇，盐类如硫酸铵，以及单宁等。沉淀法大都以丙酮粉作为酶的来源，沉淀剂对酶及蛋白质进行沉淀，从而将生姜蛋白酶从大量的杂质中分离出来，制成丙酮粉后还可以在低温下长期保藏，其性质十分稳定；唐晓珍首先报道了采用超滤法提取生姜蛋白酶，基本工艺如下：生姜→洗净→切碎→榨汁→离心除去淀粉→抽滤→超滤→取浓汁→真空冷冻干燥保存。

近几年的一些新的提取方法，则综合运用了上述各种方法，例如：2000年，Kyung在研究生姜蛋白酶的氨基酸序列时，采用如下的提取方法：生姜切成小块，3℃下，在1000 mL 20 mM 7.0 的磷酸缓冲液中研磨，混合物搅拌 1 h 然后用纱布过滤，取滤液。滤渣再用500 mL缓冲液浸提，过滤，合并滤液，加入2％的氯化钠，搅拌 2 h，在4℃下15000g离心30 min。上清液用硅藻土过滤以除去悬浮物，然后加入硫酸铵至20％饱和度，将溶液搅拌1 h，然后13000g离心30 min，上清液继续添加硫酸铵至60％饱和度，用NaOH调节pH至7.2，4℃下搅拌3h，离心取沉淀，用约150mL 20 mM pH为7.0的磷酸缓冲液（含有5 mM的连四硫酸钠）溶解。溶液用截流分子量为12000的透析袋对20 mM pH为7.0的磷酸缓冲液（其中含有5 mM的连四硫酸钠，1mMEDTA）透析16 h以上。透析液在4℃下10000g离心30min以除去任何不溶性物质的粗酶液，并在此基础上进行层析纯化。又如：2005年，Adulyatham等在研究生姜蛋白酶的部分纯化和稳定性的时候采用如下的提取方法[：鲜姜，切片，与4倍（w/v）的冷Tris-盐酸缓冲溶液（0.05M, pH8.0）混合均匀，均质，四层纱布过滤，滤液在5℃，12000g的离心机中离心20 min。上清液，即生姜蛋白酶，在5℃保存。[3]

谢芳在其硕士学位研究论文中研究了双水相提取纯化生姜蛋白酶的技术，提出了三步双水相萃取的方案。生姜粗酶液3ml +PEG、盐（30%PEG+10%（NH4）2SO4）----取上相+盐（20%

（NH4）2SO4 10ml）---取上相+盐（12%（NH4）2SO4 15ml）---下相即为提取纯化后的生姜蛋白

酶酶液。在其研究中获得了一系列提取生姜蛋白的最佳条件，如PEG最佳分子量为4000，PEG最佳浓度为25%，硫酸铵为最佳盐类„„

反胶束在提取纯化生姜蛋白酶的报道较少，但在提取其他植物蛋白酶已经有所研究及报告。反胶束萃取技术是基于液-液萃取的原理，通常包括萃取和反萃取过程。在有机溶剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层同邻近的蛋白质分子发生静电吸引，接着两界面形成含有蛋白质的反胶束，然后扩散到有机相中，实现了蛋白质的萃取即前萃过程。改变水相条件(如pH 值、离子种类或离子强度)，又可使蛋白质从有机相中返回到水相中，实现了蛋白质的反萃取即后萃过程。不同的表面活性剂所形成的反胶束，其蛋白质的提取率及提取出来的蛋白质都有差异。

1 实验原理

1.1 有机溶剂沉淀蛋白质原理

有机溶剂沉淀法的机理一般可分为两种：早起人们认为加入有机溶剂后，会使水的介电常数降低，从而使蛋白质分之间的静电引力增大，而导致凝集和沉淀；后来又提出另一种说法，认为有机溶剂沉淀法的作用机理是蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂取代，从而降低他们的溶解度。近年来又有说法认为有机溶剂可能破坏蛋白质的某种键，使其空间结构发生某种程度的变化，使疏水基团暴露于表面，并与有机溶剂结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀，当空间结构发生形变到一定程度时便会导致完全的变性。

1.2 盐析法

在蛋白质溶液中加入中性盐会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，而在布朗运动的相互碰撞下蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。

1.3 双水相萃取原理

由于高聚物间的互不相容性和空间阻碍作用使高聚物无法相互渗透，不能形成均一性，形成两相，利用生物物质在不相容的两水相间分配系数的差异进行萃取的，从而实现他们的分离。

1.4 反胶束萃取原理

将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂就会在水中聚集在一起形成聚集体，在通常状态下，这种聚集体是水中的胶束，称为正常胶束。若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶束。

蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程。在宏观两相界面间的表面活性剂层，同临近的蛋白质发生静电作用而形变，接着在两相界面形成包含有蛋白质的反胶束，此胶束扩散进入有机相，从而实现蛋白质的萃取，。

改变水相条件又可以使蛋白质由有机相重返水相，实现反萃取过程。

2 实验部分

2.1 材料、试剂与仪器

2.1.2 实验原料

市售新鲜生姜

2.1.3 主要试剂

磷酸缓冲液（0.05mol/l,pH7.5），无水乙醇，柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（0.05mol/l pH6.0）, 丙酮, 硫酸铵，PEG（分子量为1000,2000,4000）， NaH2 PO4 -Na2 HPO4 （PH6.5），40%PBS，异辛烷，AOT，0.2MKCL、0.4MKCL、0.1MNaCl、0.2 MNaCl、0.4 MNaC，CTAB，正辛醇，考马斯亮蓝 G-250 溶液，牛血清蛋白，酪蛋白标准样，0.4mol/l 三氯乙酸，

2.1.4 主要仪器

研钵，容量瓶，试管，离心机，离心管，移液管，紫外分光光度计，

2.2 实验方法

2.2.1 生姜蛋白酶的常规提取纯化工艺

2.2.1.1生姜蛋白酶的提取

取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50 g，切成小块，按料液比 1：2加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5），研磨匀浆30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4℃静置2h后，离心（4000rpm，10 min）去除沉淀，上清液用磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）定容至100mL（生姜蛋白酶溶液A），4℃冰箱贮存待用。

取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。

2.2.1.2乙醇沉淀法

取生姜蛋白酶溶液A 20mL，加入1.5 倍的无水乙醇进行沉淀，4℃静置 过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL（生姜蛋白酶溶液B）。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。

2.2.1.3丙酮沉淀法

取生姜蛋白酶溶液A 20mL，加入1.5 倍的4℃预冷丙酮进行沉淀，4℃静置 过夜后，离

心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL（生姜蛋白酶溶液C）。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。

2.2.1.4盐析法

取生姜蛋白酶溶液A 20mL，加入固体硫酸铵至 40%饱和度，4℃静置 30min后，离心（4000rpm，10 min），收集上清液继续加入硫酸铵至 60%的饱和度，4℃静置 过夜后，离心（4000rpm，10 min），收集沉淀。0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL（生姜蛋白酶溶液D）。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。

2.2.2 生姜蛋白酶聚乙二醇/硫酸铵双水相萃取工艺

2.2.2.1 生姜蛋白酶的提取

取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50 g，切成小块，按料液比 1：2加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5），研磨（粉碎）匀浆30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4℃静置 2 h，离心（4000rpm，10 min）去除沉淀，上清液加入1.5 倍的4℃预冷丙酮进行沉淀，4℃静置过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至25mL。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。

2.2.2.2 聚乙二醇/硫酸铵双水相体系相图的绘制

以PEG4000/硫酸铵体系为例进行相图的绘制。取40%PEG4000溶液（%）10 mL 于三角瓶中，用40%硫酸铵溶液（%）装入滴定管中滴定至三角瓶中溶液恰好浑浊，记录硫酸铵消耗的体积。再用滴定管加入适量水，使体系澄清，计量加入的水，并继续用硫酸铵滴定至恰好浑浊，如此反复操作，记录每次硫酸铵消耗的体积，计算每次出现浑浊时体系中PEG和硫酸铵的浓度（%），并填入表1中。以硫酸铵的浓度（%）为横坐标，PEG浓度（%）为纵坐标，绘制出PEG4000-硫酸铵双水相体系相图。

表1 PEG4000/硫酸铵双水相体系相图制作表（PEG4000= g; 温度t= ℃）

H2O累计 硫酸铵溶液 编号 添加量（mL） 读数（mL）

1

2

3

......

。三角瓶中 纯硫酸铵 累积量（g） 溶液 PEG4000浓度 总体积（mL） （%） 硫酸铵浓度 （%）

2.2.2.3 聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取生姜蛋白酶

称取不同分子量的PEG(1000、2000、4000)溶解于水配置成40%浓度的系列溶液备用。硫酸铵配制成40%溶液备用。

按下表加入各物质，振荡均匀后静置2h待其分相，记录分相情况。若分相，分别读取上下相体积，并测定上下相中蛋白含量和蛋白酶活性。

表2 PEG/硫酸铵双水相萃取生姜蛋白酶体系组成

40%硫酸铵溶液 粗酶液 水

mL mL mL

4 1 0 3 1 1

2 1 2

4 1 1

3 1 2

2 1 3

4 1 2

3 1 3

2 1 4 40%PEG溶液 mL 5 5 5 4 4 4 3 3 3 总体积 mL 10 10 10 10 10 10 10 10 10

按以下各式计算相比R、酶分配系数Ke（比酶活）、蛋白分配系数Kp：

R=上相比酶活上相蛋白质量上相体积Ke=Kp= 下相蛋白质量下相比酶活下相体积

2.2.3 生姜蛋白酶聚乙二醇/磷酸盐双水相萃取工艺

2.2.3.1 生姜蛋白酶的提取

取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50 g，切成小块，按料液比 1：2加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5），研磨（粉碎）匀浆30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4℃静置 2 h，离心（4000rpm，10 min）去除沉淀，上清液加入1.5 倍的4℃预冷丙酮进行沉淀，4℃静置过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至25mL。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。

2.2.3.2 聚乙二醇/磷酸盐双水相体系相图的绘制

以PEG4000/NaH2PO4-Na2HPO4（pH6.5）体系为例进行相图的绘制。取40%PEG4000溶液（%）10 mL 于三角瓶中，用20%pH6.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液（%）装入滴定管中滴定至三角瓶中溶液恰好浑浊，记录NaH2PO4-Na2HPO4消耗的体积。再用滴定管加入适量水，使体系澄清，计量加入的水，并继续用NaH2PO4-Na2HPO4滴定至恰好浑浊，如此反复操

作，记录每次NaH2PO4-Na2HPO4消耗的体积，计算每次出现浑浊时体系中PEG和NaH2PO4-Na2HPO4的浓度（%），并填入表3中。以NaH2PO4-Na2HPO4的浓度（%）为横坐标，PEG浓度（%）为纵坐标，绘制出PEG4000/NaH2PO4-Na2HPO4双水相体系相图。

。表3 PEG4000/NaH2PO4-Na2HPO4双水相体系相图制作表（PEG4000= g; 温度t= ℃）

H2O累计 磷酸盐溶液编号 添加量（mL） 读数（mL）

1

2

3

…… 三角瓶中 纯磷酸盐累积量（g） 溶液总体积 （mL） PEG4000浓度 （%） 磷酸盐浓度 （%）

2.2.3.3 聚乙二醇/磷酸盐双水相体系萃取生姜蛋白酶

40%聚乙二醇溶液：称取不同分子量的PEG(1000、2000、4000)溶解于水配置成40%浓度的系列溶液备用。

40%PBS缓冲液：按一定比例配置pH系列（6.0、6.5、7.0）的PBS缓冲液。

按表4加入各物质，振荡均匀后静置2h待其分相，记录分相情况。若分相，分别读取上下相体积，并测定上下相中蛋白含量和蛋白酶活性。

表4 PEG/NaH2PO4-Na2HPO4双水相萃取生姜蛋白酶

40%PBS溶液 粗酶液 水

mL mL mL

4 1 0

3 1 1

2 1 2

4 1 1

3 1 2

2 1 3

4 1 2

3 1 3

2 1 4 40%PEG溶液 mL 5 5 5 4 4 4 3 3 3 总体积 mL 10 10 10 10 10 10 10 10 10

按以下各式计算相比R、酶分配系数Ke（比酶活）、蛋白分配系数Kp：

R=上相比酶活上相蛋白质量上相体积Ke=Kp= 下相蛋白质量下相比酶活下相体积

2.2.4 生姜蛋白酶AOT/异辛烷反胶束萃取工艺

2.2.4.1 生姜蛋白酶的提取

取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50 g，切成小块，按料液比 1：2加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5），研磨（粉碎）匀浆30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4℃静置 2 h，离心（4000rpm，

10 min）去除沉淀，上清液加入1.5 倍的4℃预冷丙酮进行沉淀，4℃静置过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至25mL。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。

2.2.4.2 AOT/异辛烷反胶束溶液的配制

以异辛烷为溶剂配制浓度为0.05mol/L的AOT溶液。按表5所示，向溶液中加入各试剂，混匀后3000r/min离心30min得澄清透明溶液即为反胶束溶液（底层有少量水不影响实验结果；若不澄清透明即不能形成反胶束溶液），计算体系含水量W0。（体系中含水量 Wo是指反胶束体系中水(缓冲溶液)与表面活性剂的物质的量之比, 即Wo＝[H2O]/[S]总。）若形成反胶

束溶液，则继续进行2.2.4.3步骤。

表5 AOT/异辛烷反胶束体系萃取生姜蛋白酶

AOT溶液体积 0.1MKCl溶液体积 W0 mL mL

10 0.18 10 0.27

10 0.36 编号 1 2 3 是否形成反胶束

分别以0.2M KCl、0.4M KCl溶液代替表中0.1M KCl溶液，同法操作。

2.2.4.3 AOT/异辛烷反胶束萃取生姜蛋白酶

移取10mL生姜蛋白酶提取液加入上述AOT/异辛烷反胶束体系中，搅拌萃取60min，静置分层后，测定上下相体积，并从下相中取样测定蛋白含量和蛋白酶活（上相中蛋白含量和酶活由总蛋白和总酶活减去下相而得）。按以下各式计算相比R、酶分配系数Ke（比酶活）、蛋白分配系数Kp：

上相比酶活上相蛋白质量上相体积R= Ke= Kp= 下相蛋白质量下相比酶活下相体积

2.2.5 生姜蛋白酶CTAB/正辛醇反胶束萃取工艺

2.2.5.1 生姜蛋白酶的提取

取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50 g，切成小块，按料液比 1：2加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5），研磨（粉碎）匀浆30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4℃静置 2 h，离心（4000rpm，10 min）去除沉淀，上清液加入1.5 倍的4℃预冷丙酮进行沉淀，4℃静置过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸

—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至25mL。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。

2.2.5.2 CTAB/正辛醇反胶束溶液的配制

以正辛醇为溶剂配制浓度为0.05mol/L的CTAB溶液。按表6所示，向溶液中加入各试剂，混匀后3000r/min离心30min得澄清透明溶液即为反胶束溶液（底层有少量水不影响实验结果；若不澄清透明即不能形成反胶束溶液），计算体系含水量W0。（体系中含水量 Wo是指反胶束体系中水(缓冲溶液)与表面活性剂的物质的量之比, 即Wo＝[H2O]/[S]总。）若形成反胶束溶液，则继续进行2.2.5.3步骤。

表6 CTAB/正辛醇反胶束体系萃取生姜蛋白酶

AOT溶液体积 0.1MKCl溶液体积 W0 mL mL

10 0.18 10 0.27

10 0.36 编号 1 2 3 是否形成反胶束

分别以0.2M KCl、0.4M KCl溶液代替表中0.1M KCl溶液，同法操作。

2.2.5.3 CTAB/正辛醇反胶束萃取生姜蛋白酶

移取10mL生姜蛋白酶提取液加入上述CTAB/正辛醇反胶束体系中，搅拌萃取60min，静置分层后，测定上下相体积，并从下相中取样测定蛋白含量和蛋白酶活（上相中蛋白含量和酶活由总蛋白和总酶活减去下相而得）。按以下各式计算相比R、酶分配系数Ke（比酶活）、蛋白分配系数Kp：

上相比酶活上相蛋白质量上相体积Ke=Kp=R= 下相蛋白质量下相比酶活下相体积

2.2.6 蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝 G-250法 [3]测定蛋白质浓度。考马斯亮蓝 G-250 溶液的配制：准确称取 250 mg 考马斯亮蓝 G-250，用 125 mL 浓度 95%的乙醇溶解后加入 250 mL 85%磷酸，最后用蒸馏水定容至 500 mL，过滤至棕色瓶中，4℃保存备用，使用前进行五倍稀释。

2.2.6.1 标准曲线绘制

以牛血清白蛋白为标准品，用蒸馏水配成 0.1mg/mL 的标准溶液，按表7加入各反应试剂后，于2~10 min 内测定595 nm波长处吸光度，绘制牛血清蛋白质量~A595标准曲线，建立标准曲线方程。

表7 牛血清清蛋白标准曲线制作加样表

1 2 3 4 管号

0 0.1 0.2 0.4 0.1mg/mL牛血清清蛋白溶液/mL

1.0 0.9 0.8 0.6 蒸馏水/mL

5.0 5.0 5.0 5.0 考马斯亮蓝G-250 /ml

0 0.01 0.02 0.04 标准蛋白质质量/mg

A

5

0.6 0.4 5.0 0.06 6 0.8 0.2 5.0 0.08 7 1.0 0 5.0 0.10

2.2.6.2 样品蛋白含量的测定

取待测样品1 mL，按表5中的7号管加入试剂，于2~10 min 内测定595 nm波长处吸光度（以表7中1号管为空白对照）。根据标准曲线方程计算样品中蛋白含量。

2.2.7 生姜蛋白酶活力测定

按文献[4] 方法进行生姜蛋白酶活力的测定。生姜蛋白酶活力的定义：在50℃、pH6.0条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸的酶量，定义为1个蛋白酶活力单位。 2.2.7.1 酪氨酸标准曲线的绘制

取酪氨酸标准样（105℃烘 3h）用 0.2mol/L的盐酸配成0、20、40、60、80、100 μg/mL 的酪氨酸标准溶液，以 0.2 mol/L 的盐酸为对照测定不同浓度酪氨酸溶液在 275 nm 下的吸光度。以酪氨酸浓度为横坐标，A275值为纵坐标绘制标准曲线，建立标准曲线方程。 2.2.7.2 样品蛋白酶活力的测定

在干燥洁净试管内加入1%酪蛋白1 mL，置于 50 ℃水浴中预热 2 min，再加入经同样预热的酶液 1 mL（酪蛋白溶液与酶液均以 0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液配制），精确保温反应 4 min后，立即在每管中加入 0.4 mol/L 三氯乙酸 4 mL终止反应，待残余蛋白质沉淀后过滤，取滤液测定A275。

空白实验测定方法同上，唯在反应之前先将 0.4 mol/L 三氯乙酸4 mL加入至1mL酶液中预热，使酶失活后，再加入至酪蛋白溶液中进行反应。冷至室温后的空白实验管用作仪器校零。

根据A275值所对应的酪氨酸的含量，按以下公式计算酶的比活力：

生姜蛋白酶比酶活 =

A⨯V1000

⨯ tB⨯v

式中：A 为测得A275值后，查标准曲线所得的酪氨酸的含量，μg/mL；t 为酶促反应时间，定为 4 min；V 为反应液的体积，6 mL；B 为酶液蛋白含量，μg/mL；v 为酶促反应所用酶液的体积，为 1 mL；1000 为 1 mg 相当于 1000 μg的系数。

3 结果与讨论

3.1 标准曲线的绘制

3.1.1 牛血清蛋白标准曲线

表8牛血清蛋白吸光值

标准蛋白质质量/mg

A595

0 0

0.01 0.036

0.02 0.145

0.04 0.261

0.06 0.424

0.08 0.498

0.1 0.585

0.70.60.5

A595

0.40.30.20.100

0.02

0.040.060.08标准蛋白质质量/mg

0.1

0.12

图1 牛血清蛋白标准曲线

3.1.2 酪氨酸标准曲线

表9 酪氨酸吸光值

酪氨酸含量 A275

20 0.134

40 0.27

60 0.414

80 0.53

100 0.695

图2酪氨酸标准曲线

3.2 生姜蛋白酶常规工艺提取

按2.2.1方法对生姜蛋白酶进行提取和常规纯化，并测定其蛋白含量和酶活，结果见表10。

表10 生姜蛋白酶分离纯化结果

样品 生姜蛋白酶溶液A 生姜蛋白酶溶液B 生姜蛋白酶溶液C 生姜蛋白酶溶液D 注：样品体积均为20mL

总蛋白 （mg） 16.19 2.08 1.62 3.16

总酶活 (IU) 145.54 70.34 114.53 91.01

比活力 (IU/mg) 8.99 33.89 70.61 28.79

回收率 (%) 100 48.33 78.69 62.53

纯化倍数 1 3.77 7.85 3.20

表10结果表明，丙酮沉淀法制备的生姜蛋白酶回收率和纯化倍数均优于其他方法，因此在后续实验中采用丙酮粉法对生姜蛋白酶进行初步纯化。

3.3 生姜蛋白酶聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取

3.3.1 聚乙二醇/硫酸铵双水相体系的相图

表11 PEG2000硫酸铵双水相体系相图制作数据

水累计添加量（ml）

硫酸铵溶液°数（ml） 1.40

纯硫酸铵积累溶液总体积量（g） 0.56

PEG2000浓度（g/ml） 0.35

硫酸铵浓度（g/ml） 0.05

（ml） 11.40

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1.80 2.40 2.90 3.50 4.10 4.70 5.40 6.10 6.80

0.72 0.94 1.14 1.38 1.62 1.86 2.14 2.44 2.72

12.80 14.40 15.90 17.50 19.30 20.90 22.60 24.30 26.00

0.31 0.28 0.25 0.23 0.21 0.19 0.18 0.16 0.15

0.06 0.07 0.07 0.08 0.08 0.09 0.09 0.10 0.10

0.40

PEG浓度g/ml

0.300.200.100.00

0.00

0.05

0.100.15

硫酸铵浓度g/ml

图3 聚乙二醇2000/硫酸铵双水相体系的相图

3.3.2 萃取效果的影响因素

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

PEG分子量 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 2000 2000 PEG浓度 （%） 20 20 20 16 16 16 12 12 12 20 20 硫酸铵浓度 （%） 16 12 8 16 12 8 16 12 8 16 12

相比R 0.82 1.86 —— 0.72 —— —— —— —— —— 1.00 1.56

蛋白分配系数

Kp

1.42 1.73 —— 1.03 —— —— —— —— —— 0.86 1.79

比酶活分配系数

Ke

0.18 0.69 —— 1.46 —— —— —— —— —— 60.78 11.26

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 20 16 16 16 12 12 12 20 20 20 16 16 16 12 12 12 8 16 12 8 16 12 8 16 12 8 16 12 8 16 12 8

—— —— —— —— —— —— —— 0.89 1.35 2.72 0.67 1.00 9.00 0.43 0.67 ——

—— —— —— —— —— —— —— 0.85 1.34 0.76 5.53 1.88 4.78 0.48 0.67 ——

—— —— —— —— —— —— —— 0.01 0.11 0.79 0.05 0.22 0.99 2.48 2.51 ——

3.3.2.1 聚乙二醇分子量对萃取效果的影响

根据表12 的结果计算出不同PEG分子量时的Kp和Ke平均值，结果如图4所示

表13 不同PEG分子量时的Kp和Ke平均值

PEG分子量 1000 2000 4000

蛋白分配系数Kp平均值 比酶活分配系数Ke平均值

1.393 1.325 2.0362

0.7766 36.02 0.895

图4 PEG分子量对生姜蛋白酶萃取效果的影响

由图4可知，对生姜蛋白的萃取效果而言，PEG1000和PEG2000对生姜蛋白的萃取效

果相差不大，而PEG4000萃取生姜蛋白的效果优于PEG1000、PEG2000，其平均Kp可达2.03。所试验的三种PEG对生姜蛋白的萃取分配系数均大于1，说明在此条件下，蛋白主要分配于上相。从生姜蛋白酶萃取效果来看，PEG分子量为1000、2000和4000时，其对应的Ke平均值分别为0.78、36.02和0.90，可见采用PEG2000所构成双水相体系对生姜蛋白酶的萃取效果最好

3.3.2.2 聚乙二醇浓度对萃取效果的影响

表14 不同PEG浓度时的Kp和Ke平均值

PEG浓度

16% 12% 20%

蛋白分配系数Kp平均值 比酶活分配系数Ke平均值

3.02 0.575 1.25

0.588 2.495 10.54571

图5 PEG浓度对生姜蛋白酶萃取效果的影响

由图5可知，对生姜蛋白的萃取效果而言，不同浓度PEG对生姜蛋白的萃取效果相差较大，浓度16%时萃取效果最好，其平均Kp可达3.02。所试验的三种浓度对生姜蛋白的萃取，只有浓度为12%时蛋白主要分配于下相。从生姜蛋白酶萃取效果来看，浓度为20%时，其比酶活分配系数Ke平均值为10.54，可见采用PEG浓度为20%时所构成双水相体系对生姜蛋白酶的萃取效果最好。

3.3.2.3 硫酸铵浓度对萃取效果的影响

表15 不同硫酸铵浓度时的Kp和Ke平均值

硫酸铵浓度

16% 12% 8%

蛋白分配系数Kp平均值 比酶活分配系数Ke平均值

1.695 1.482 2.77

10.82667 2.958 0.89

图6 硫酸铵浓度对生姜蛋白酶萃取效果的影响

由图6可知，硫酸铵浓度为8%时对生姜蛋白的萃取效果最好，其平均Kp为2.77。所试验的三种浓度对生姜蛋白的萃取，Kp平均值均大于1，蛋白主要分配于上相。从生姜蛋白酶萃取效果来看，Ke平均值随浓度降低而降低，Ke平均值最大为10.82，可见硫酸铵浓度为16%时所构成双水相体系对生姜蛋白酶的萃取效果最好。

3.4 生姜蛋白酶聚乙二醇/磷酸盐双水相体系萃取

3.4.1 聚乙二醇/磷酸盐双水相体系的相图

表16 PEG2000-PBS相图制作数据

水累计添加量（ml）

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0

PBS溶液读数（ml） 2.40 3.10 3.70 4.40 5.10 5.80

纯PBS累积量

（g） 0.96 1.24 1.48 1.76 2.04 2.32

溶液总体积（ml） 12.40 14.10 15.70 17.40 19.10 20.80

PEG2000浓度(g/ml) 0.32 0.28 0.25 0.23 0.21 0.19

PBS浓度(g/ml) 0.08 0.09 0.09 0.10 0.11 0.11

6.0 7.0 8.0 9.0

6.50 7.20 7.80 8.50

2.60 2.80 3.12 3.40

22.50 24.20 25.80 27.50

0.18 0.17 0.16 0.15

0.12 0.12 0.12 0.12

PH=6.5

PEG2000-PBS双水相图

0.400.35

PEG2000浓度g/ml

0.300.250.200.150.100.050.00

0.00

0.05

0.10

PBS浓度g/ml

0.15

图7聚乙二醇2000/PBS双水相体系的相图

3.4.2 萃取效果的影响因素

按2.2.3.2方法，分别改变聚乙二醇分子量、聚乙二醇浓度、PBS浓度和pH进行分相和萃取实验，结果见表16。

表17 聚乙二醇/PBS双水相体系萃取生姜蛋白酶实验结果

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

PEG分子量 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

PEG浓度 （%） 20 20 20 20 20 20 20 20 20 16 16 16 16

PBS浓度 （%） 16 12 8 16 12 8 16 12 8 16 12 8 16

PBS pH 6.0 6.0 6.0 6.5 6.5 6.5 7.0 7.0 7.0 6.0 6.0 6.0 6.5

相比R —— —— —— —— —— —— 1.08 1.27 4.56 —— —— —— ——

蛋白分配系数

Kp

—— —— —— —— —— —— 1.08 1.27 4.56 —— —— —— ——

比酶活分配系数

Ke

—— —— —— —— —— —— 0.13 0.73 1.01 —— —— —— ——

14 1000 15 1000 16 1000 17 1000 18 1000 19 1000 20 1000 21 1000 22 1000 23 1000 24 1000 25 1000 26 1000 27 1000 28 2000 29 2000 30 2000 31 2000 32 2000 33 2000 34 2000 35 2000 36 2000 37 2000 38 2000 39 2000 40 2000 41 2000 42 2000 43 2000 44 2000 45 2000 46 2000 47 2000 48 2000 49 2000 50 2000 51 2000 52 2000 53 2000 54 2000 55 4000 56 4000 57 4000 58 4000 59 4000 16 12 16 8 16 16 16 12 16 8 12 16 12 12 12 8 12 16 12 12 12 8 12 16 12 12 12 8 20 16 20 12 20 8 20 16 20 12 20 8 20 16 20 12 20 8 16 16 16 12 16 8 16 16 16 12 16 8 16 16 16 12 16 8 12 16 12 12 12 8 12 16 12 12 12 8 12 16 12 12 12 8 20 16 20 12 20 8 20 16 20 12 6.5 2.33 6.5 —— 7.0 0.67 7.0 1.00 7.0 —— 6.0 —— 6.0 —— 6.0 —— 6.5 0.54 6.5 —— 6.5 —— 7.0 0.82 7.0 1.38 7.0 —— 6.0 1.50 6.0 2.33 6.0 —— 6.5 1.00 6.5 0.82 6.5 —— 7.0 1.22 7.0 2.33 7.0 0.67 6.0 —— 6.0 1.50 6.0 —— 6.5 —— 6.5 —— 6.5 —— 7.0 —— 7.0 2.33 7.0 1.22 6.0 —— 6.0 —— 6.0 —— 6.5 —— 6.5 —— 6.5 —— 7.0 —— 7.0 —— 7.0 —— 6.0 1.27 6.0 2.23 6.0 4.56 6.5 1.00 6.5 1.94 2.26 1.74 —— —— 6.61 0.66 0.96 1.13 —— —— —— —— —— —— —— —— 0.68 0.19 —— —— —— —— 0.59 0.42 1.93 0.32 —— —— 1.34 0.15 1.85 2.24 —— —— 1.52 1.34 0.47 2.14 —— —— 0.97 3.90 1.85 1.67 0.63 3.45 —— —— 0.59 4.61 —— —— —— —— —— —— —— —— —— —— 0.32 5.12 0.26 7.70 —— —— —— —— —— —— —— —— —— —— —— —— —— —— —— —— —— —— 1.19 2.90 0.69 0.55 2.23 1.21 0.80 16.63 2.68 1.10

60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 20 20 20 20 16 16 16 16 16 16 16 16 16 12 12 12 12 12 12 12 12 12 8 16 12 8 16 12 8 16 12 8 16 12 8 16 12 8 16 12 8 16 12 8 6.5 7.0 7.0 7.0 6.0 6.0 6.0 6.5 6.5 6.5 7.0 7.0 7.0 6.0 6.0 6.0 6.5 6.5 6.5 7.0 7.0 7.0 3.55 1.63 1.86 1.63 0.50 2.25 —— 0.82 1.22 2.57 0.54 0.82 1.22 0.44 0.98 —— 0.54 0.82 —— 0.72 0.67 1.00 2.61 0.62 0.89 1.05 0.54 1.74 —— 0.57 0.65 1.23 0.33 0.97 0.87 4.32 0.51 —— 0.34 0.30 —— 0.54 0.45 0.78 0.89 0.54 17.60 30.71 0.38 2.42 —— 2.80 1.28 1.63 2.14 1.23 2.59 0.10 1.22 —— 50.69 0.50 —— 6.63 6.25 1.58

结果表明，PEG4000最容易形成两相，（对表中结果略加描述和讨论，例如成两相的情况，相比与分子量、浓度等的大致关系等）。 3.4.2.1 聚乙二醇分子量对萃取效果的影响

根据表16的结果计算出不同PEG分子量 、不同PH值、不同PEG浓度、不同PBS浓度时的Kp和Ke平均值，如表18

表18 不同PEG分子量 、不同PH值、不同PEG浓度、不同PBS浓度时的Kp和Ke平均值

项目

PEG1000 PEG2000 PEG4000 Pbs PH=6 Pbs PH=6.5 Pbs PH=7.0 PEG 浓度20% PEG 浓度 16% PEG 浓度 12%

平均蛋白分配系数Kp 平均比酶活分配系数Ke

2.215556 0.98 1.120833 1.348333 1.175833 1.310952 1.781905 1.278571 1.044

0.703333 3.232 6.39875 2.083333 6.744167 4.548095 4.329048 2.530714 6.79

pbs浓度16% pbs浓度 12% pbs浓度 8%

1.3775 1.132222 1.58

5.6 2.880556 5.641111

聚乙二醇分子量对萃取效果的影响结果如图8所示

图8 PEG分子量对生姜蛋白酶萃取效果的影响

由图8可知，对生姜蛋白的萃取效果而言，PEG2000和PEG4000对生姜蛋白的萃取效果相差不大，而PEG1000萃取生姜蛋白的效果优于PEG4000、PEG2000，其平均Kp可达2.21。在PEG=1000时，蛋白主要分配于上相。从生姜蛋白酶萃取效果来看，PEG分子量为1000、2000和4000时，其对应的Ke平均值分别为0.703333、 3.232、 6.39875，呈递增关系，可见采用PEG4000所构成双水相体系对生姜蛋白酶的萃取效果最好。 3.4.2.2 聚乙二醇浓度对萃取效果的影响

根据表16的结果计算出不同PEG浓度时的Kp和Ke平均值，结果如图9所示。

图9 PEG浓度对生姜蛋白酶萃取效果的影响

由图9可知，PEG浓度为20%时对生姜蛋白萃取效果最好，Kp=1.78，Kp均大于1，生姜蛋白主要分布在上相。而当PEG浓度为12%时对生姜蛋白酶的萃取效果最好Ke为6.79. 3.4.2.3 磷酸盐缓冲液pH对萃取效果的影响

根据表16的结果计算出不同pH的PBS缓冲液对应的Kp和Ke平均值，结果如图10所示。

图10 PBS缓冲液pH对生姜蛋白酶萃取效果的影响

由图10可知，在PH=6.5时，对生姜蛋白的萃取效果最差，而对生姜蛋白酶的萃取效果最好。在三种不同PH下，Kp均大于1，即生姜蛋白主要分布于上相。 3.4.2.4 磷酸盐浓度对萃取效果的影响

根据表16的结果计算出不同浓度的PBS缓冲液对应的Kp和Ke平均值，结果如图10所示。

图11 PBS缓冲液浓度对生姜蛋白酶萃取效果的影响

由图11可知，当PBS浓度为8%时，Kp和Ke均达最大值，即此时的浓度对萃取生姜蛋白和生姜蛋白酶都较好。并且Kp均大于1，生姜蛋白主要分布于上相。

3.5 生姜蛋白酶AOT/异辛烷反胶束体系萃取

表19 AOT/异辛烷反胶束体系萃取生姜蛋白酶实验结果

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9

KCl浓度 （mol/L）

0.1 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.4

W0 20 30 40 20 30 40 20 30 40

相比R 0.74 1.22 1.00 0.94 0.98 0.92 0.39 0.43 0.33

蛋白分配系数

Kp

0.21 0.56 0.11 7.01 8.08 7.05 1.79 1.42 1.94

比酶活分配系数

Ke

0.38 0.30 0.41 1.39 1.72 1.45 0.76 1.48 1.87

表20 不同W0、KCl浓度对AOT/异辛烷反胶束体系萃取生姜蛋白酶的影响

kcl浓度0.1M

0.2M

0.4M

平均蛋白分配系数Kp 平均比酶活分配系数Ke

0.293333 7.38 1.716667

3.003333 3.353333 3.033333

0.363333 1.52 1.37 0.843333 1.166667 1.243333

含水量20

30 40

3.5.1 KCl浓度对萃取效果的影响

图12 KCl浓度对萃取效果的影响

由图12可知KCL浓度等于0.2M时，Kp=7.38，Ke=1.52，都达到了最大值，此时萃取两种蛋白质的效果都较好。

3.5.2 W0对萃取效果的影响

图13 W0对萃取效果的影响

由图13可知含水量越多，对提取生姜蛋白酶效果越好，对于萃取生姜蛋白，当含水量为30时效果最好。

3.6 生姜蛋白酶CTAB/正辛醇双水相体系萃取

表21 CTAB/正辛醇双水相体系萃取生姜蛋白酶实验结果

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9

KCl浓度 （mol/L）

0.1 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.4

W0 20 30 40 20 30 40 20 30 40

相比R 1.22 1.22 1.00 1.22 1.38 1.17 1.44 2.33 2.03

蛋白分配系数

Kp

1.07 0.68 0.63 60.12 74.04 55.21 5.65 4.91 2.48

比酶活分配系数

Ke

0.52 0.09 0.79 25.09 23.04 58.23 1.37 2.51 2.05

表22不同W0、KCl浓度对CTAB/正辛醇反胶束体系萃取生姜蛋白酶的影响

项目 kcl浓度0.1M

0.2M

0.4M

平均蛋白分配系数Kp 平均比酶活分配系数Ke

0.793333 63.12333 4.346667

22.28 26.54333 19.44

0.466667 35.45333 1.976667

8.993333 8.546667 20.35667

含水量 20

30 40

3.6.1 KCl浓度对萃取效果的影响

图14 KCl浓度对萃取效果的影响

当KCL浓度为0.2时，无论是萃取生姜蛋白还是萃取生姜蛋白酶，萃取都远远比其他两种浓度明显。

3.6.2 W0对萃取效果的影响

图15 W0对萃取效果的影响

由图15知含水量为20和30是对生姜蛋白和生姜蛋白酶的萃取效果区别不大，Kp均远远大于1，蛋白质主要分布于上相。含水量为40是对萃取生姜蛋白酶效果最好，Ke=20.35

4 结论

经过对实验结果数据分析，丙酮沉淀法制备的生姜蛋白酶回收率和纯化倍数均优于其他方法，因此在后续实验中采用丙酮粉法对生姜蛋白酶进行初步纯化。

在PEG-硫酸铵体系中，对生姜蛋白酶的萃取效果而言，PEG2000所构成双水相体系对生姜蛋白酶的萃取效果最好，采用PEG浓度为20%时所构成双水相体系对生姜蛋白酶的萃取效果最好。采用硫酸铵浓度为16%时所构成双水相体系对生姜蛋白酶的萃取效果最好。 对于萃取生姜蛋白，PEG4000萃取生姜蛋白的效果优于PEG1000、PEG2000，浓度16%的萃取效果最好，硫酸铵浓度为8%时对生姜蛋白的萃取效果最好。

在PEG-PBS中对生姜蛋白的萃取效果而言，PEG1000萃取生姜蛋白的效果优于PEG4000、PEG2000，。在PEG=1000时，采用PEG4000所构成双水相体系对生姜蛋白酶的萃取效果最好。PEG浓度为20%时对生姜蛋白萃取效果最好，当PEG浓度为12%时对生姜蛋白酶的萃取效果最好。在PH=6.5时，对生姜蛋白的萃取效果最差，而对生姜蛋白酶的萃取效果最好。 PBS浓度为8%时，Kp和Ke均达最大值，即此时的浓度对萃取生姜蛋白和生姜蛋白酶都较好。

在AOT/异辛烷反胶束体系中，KCL浓度等于0.2M时，萃取两种蛋白质的效果都较好。含水量越多，对提取生姜蛋白酶效果越好，对于萃取生姜蛋白，当含水量为30时效果最好。

在CTAB/正辛醇反胶束体系中，含水量为40是对萃取生姜蛋白酶效果最好。KCL浓度为0.2时，无论是萃取生姜蛋白还是萃取生姜蛋白酶，效果都远远比其他两种浓度明显。

参考文献

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