由发酵液提取泰乐菌素C的初步研究

731中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2006, 37(11) · ·

微生物药物与生物技术

由发酵液提取泰乐菌素C的初步研究

赵体金，尹德芳，董　坤，许　平

(鲁抗舍里乐药业有限公司，山东济宁 272021)

摘要：研究了从发酵液中提取泰乐菌素C的工艺条件，确定了甲苯为萃取溶剂，在pH9.25～10.02萃取3次，继而用乙酸乙酯在pH 9.44条件下进一步萃取，30％酒石酸溶液反萃取至水相(pH 3.88)，得到纯度84％的酒石酸泰乐菌素C溶液。关键词：泰乐菌素C；提取；发酵液

中图分类号：S859.79+6　　　文献标识码：A　　　文章编号：1001-8255(2006)11-0731-03

泰乐菌素(tylosin)是禽畜专用的大环内酯类抗生素，能预防和治疗多种禽畜多发病。泰乐菌素发酵为多组分产物，其中泰乐菌素C(tyl-C)是由泰内酯(tylactone) 生物合成泰乐菌素A(tyl-A)途径中的重要中间体[1]，对研究组分转化和杂质生成机理有重要意义。tyl-C在泰乐菌素发酵液组分中约占2％～20％，提纯方法国内未见报道。

tyl-C与tyl-A的结构仅在R2上相差一个甲基(见图1)，但极性有一定差异，故理论上可通过二者在不同溶剂中的溶解性差异加以提纯。本研究报道了溶剂萃取法提纯tyl-C的探索研究。

R21 仪器与材料

高效液相色谱仪(Waters公司)。

泰乐菌素发酵液(本公司提供)；tyl-C对照品(中国兽医药品监察所，含量903µg/mg，纯度95.07％，批号K0160904)。

2 方法与结果2.1 检测方法[2]

HPLC色谱条件：色谱柱C18柱(4.6mm×200mm，5μm)；流动相 0.85mol/L高氯酸钠溶液-乙腈(18∶13)；检测波长 290nm；流速 1ml/min；进样量10µl。用HPLC测定、计算萃取分离过程中溶剂相与水相中的各组分纯度与含量。2.2 萃取溶剂及pH的选择

取泰乐菌素发酵液1L加硫酸铝调至pH3～6后过滤，滤液用1mol/L氢氧化钠溶液调至pH5～11，分别取不同pH的滤液15ml，加入甲苯或乙酸丁酯5ml振荡萃取5min，室温静置30min后分离，分别用HPLC分析水相与甲苯相或乙酸丁酯相中各组分的纯度及含量，结果见表1、2。

由表1、2可见，以甲苯萃取时，水相中tyl-C的纯度比滤液有较大提高；而以乙酸丁酯萃取时，水相中tyl-C的纯度与含量的变化都不大，因此，选定甲苯作为提纯tyl-C的溶剂。随着甲苯萃取时pH的升高，水相中tyl-A的纯度与含量均降低，而tyl-C的含量下降缓慢、纯度升高。在pH9.25～10.02之间，水相中tyl-C的纯度最高且含量下降较少，因而确定此范围为提纯tyl-C的最佳pH区间。

tyl Atyl C

R3

OCH3 CHOOH CHO

图1 泰乐菌素各组分的分子结构

收稿日期：2006-05-09

作者简介：赵体金(1969)，男，高级工程师、执业药师，从事抗生素生产技术的开发与管理。

Tel：[1**********]9

E-mail：[email protected]

732 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2006, 37(11)· · 中国医药工业杂志

表1 甲苯和水相中各组分的纯度及含量

水相

样品名称滤液(原液)

12

34567

pH

纯度/％

5.075.076.107.108.109.2510.0210.99

61.6061.2059.8055.7043.8040.4039.4039.00

tyl-A

含量/μg·ml-1

[***********][1**********]493

纯度/％25.9026.1027.1029.9038.0040.3040.6040.10

tyl-C

含量/μg·ml-1

[***********][1**********]532

纯度/％—61.9065.0074.7095.3094.7094.4092.80

tyl-A含量/μg·ml—[***********]379468513

纯度/％—26.5025.3019.303.603.904.204.80

甲苯相

tyl-C

含量/μg·ml—[***********]428

表2 乙酸丁酯萃取时水相中各组分的纯度及含量

样品名称滤液(原液)

1234567

pH

纯度/％

5.205.205.967.118.019.0210.0610.95

60.7260.7360.3760.4961.0761.0260.7760.35

tyl-A

含量/μg·ml-1

[***********][1**********]796

纯度/％25.9525.6625.7825.8026.1326.1826.2926.53

tyl-C

含量/μg·ml-1

[***********][1**********]669

2.3 甲苯萃取方法的确定

用1mol/L氢氧化钠溶液将滤液调至pH9.5～10.0后，取碱化液120ml与甲苯40ml在分液漏斗中混合，振荡摇匀后静置30min分离，分别取甲苯相和水相进行HPLC分析。其中水相调至pH9.5～10.0后再加入甲苯(水相∶甲苯相＝3∶1)进行二次萃取。反复用甲苯洗提水相5次，HPLC分析结果见图2。由图2可见，随着甲苯萃取次数的增加，水相中tyl-A的含量下降迅速，tyl-C的含量下降较慢，但水相中tyl-C的纯度逐渐增加，萃取4次后达最高值56.8％。综合考虑在本试验条件下，用甲苯萃取3次提纯tyl-C效果最佳。2.4 乙酸乙酯萃取条件的确定

由于tyl-C的极性高于tyl-A，故选取极性高于甲苯的溶剂有可能将tyl-C组分进一步浓缩提纯。乙酸乙酯的极性在甲苯与水之间，可能是适宜溶剂。将经甲苯萃取的水相调至不同pH后与乙酸乙酯混合(水相∶乙酸乙酯＝2∶1)，振荡摇匀后静置分离，HPLC分别分析水相和乙酸乙酯相中tyl-A和tyl-C，结果见表3。在萃取pH为9.44时，tyl-C在

图2 多级萃取水相中tyl-A、C

组分纯度及含量变化图

乙酸乙酯相中含量达峰值2186µg/ml，而其纯度在萃取pH7.06时达到峰值75.38％，综合考虑采取pH 9.44为萃取pH，使tyl-C在乙酸乙酯相中的纯度与含量均提高。2.5 水提条件的确定

将乙酸乙酯萃取液与水按体积比2∶1混合，用30％酒石酸溶液振摇调至不同pH，静置30min分离，HPLC分析水相中tyl-A、tyl-C组分，结果如图3。在pH3.88时，水相中tyl-C含量达峰值11202µg/ml，纯

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表3 乙酸乙酯萃取各组分的纯度和含量

水相

样品名称水相原液

12

3

pH

纯度/％

9.449.447.065.06

11.8422.1017.899.24

tyl-A

含量/μg·ml

[1**********]4

乙酸乙酯相

tyl-C

纯度/％56.6129.1437.5653.94

含量/μg·ml

[1**********]018

tyl-A

纯度/％—3.916.2615.80

含量/μg·ml

—117166246

tyl-C

纯度/％—73.1375.3850.92

含量/μg·ml—[1**********]

0.140.120.100.080.060.040.020.00-0.02

1

AU

2

2 4 6 8 10 12 14 16 18

t/min

1—tyl-C；2—tyl-A

图4 pH 3.88时水提液的HPLC分析图谱

图3 不同pH萃取时水相中tyl-A、C组分的

纯度及含量变化图

最佳pH为3.88。在上述条件下，用甲苯、乙酸乙酯、酒石酸溶液连续萃取操作，各步收率分别为62％、92％和99％。得到tyl-C产品的纯度达84％，含量12000µg/ml，总收率56％。参考文献：

[1] Baltz RH. Sweet home actinomycetes: the 1999 MDS Panlabs Lecture[J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2000, 24(2): 79-88.

[2] 戚　薇, 王建玲, 韩英素, 等. 发酵液中泰乐菌素测定方法 的研究[J]. 天津轻工业学院学报, 1999, 14(1): 1-4.

度为81.71％，略低于pH6.10和5.03时的纯度。综合考虑，选在pH3.88时将乙酸乙酯中的tyl-C萃取至水相，其HPLC分析图谱及数据见图4。3 结论

本研究确定以甲苯在水相pH9.25～10.02条件下萃取泰乐菌素发酵液，重复3次，可使tyl-C组分在水相中富集较高；以乙酸乙酯进一步萃取经甲苯洗提的泰乐菌素滤液，萃取的最佳pH为9.44；用30％酒石酸溶液从乙酸乙酯相中反萃取tyl-C的

Preliminary Study on Extraction of Tylosin C from Fermentation Broth

ZHAO Ti-Jin，YIN De-Fang，DONG Kun，XU Ping

(Lukang Shelile Pharmaceutical Co., Ltd., Jining 272021)

ABSTRACT：A process for the extraction of tylosin C from fermentation broth was investigated and optimized.

The filtrate was firstly extracted for three times using toluene at pH 9.25 - 10.02, and then the extracts were further extracted with ethyl acetate at pH 9.44. Tylosin C with the purity of 84％ was extracted again from ethyl acetate phase to water phase at pH 3.88 by 30％ tartaric acid.

Key Words：tylosin C; extraction; fermentation broth