超临界流体色谱法制备EPA_EE和DHA_EE
第54卷 第11期 化 工 学 报 Vol154 №11
() 2003年11月 Journal of Chemical Industry and Engineering China November 2003
研究论文
超临界流体色谱法制备EPA2EE和DHA2EE
王宪达 黄 梅 杨亦文 任其龙
(浙江大学二次资源化工国家专业实验室,浙江杭州310027)
摘 要 以二氧化碳作流动相,C18柱为固定相,(EPA2EE)和二
十二碳六烯酸乙酯(DHA2EE).考察了流速、温度、压力、.结果表明,在实验范围内,流速对分离效果影响不大.对于4112MPa,温度55℃,1MPal.而对于82C18,250mm×10mm
色谱柱,,℃,通常流速下的压降约为015MPa,鱼油的最大上载
μ量约为100.
关键词 二十碳五烯酸乙酯(EPA2EE) 二十二碳六烯酸乙酯(DHA2EE) 分离中图分类号 O658 文献标识码 A文章编号 0438-1157(2003)11-1558-05
SEPARATIONOFEPA2EEANDDHA2EE
WITHSUPERCRITICALFLUIDCHROMATOGRAPHY
WANGXianda,HUANGMei,YANGYiwenandRENQilong
(NationalLaboratoryofSecondaryResourcesChemicalEngineering,
ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,Zhejiang,China)
Abstract TheseparationofEicosapentaenoicAcid(EPA)andDocosahexanoicAcid(DHA)2ethylestersby
supercriticalfluidchromatography(SFC)withcarbondioxideasmobilephaseusingC18columnswasstudied1Theeffectsofflowrate,operationtemperatureandpressure,samplesizeandconcentrationonseparationwereinvestigated1Itisindicatedthattheeffectofflowrateonresolutionisnotobvious1Asfor52C18,250mm×416mmcolumn,theoptimumoperatingconditionis12MPa,55℃,pressure
drop1MPa;asfor82C18,250mm
×10mmcolumn,theoptimumoperatingconditionis12MPa,55℃,pressuredrop015MPa1Fishoilcanbeeninjecteddirectlywithoutdissolvinginothersolvents1
Keywords preparativesupercriticalfluidchromatography,eicosapentaenoicacid2EE,docosahexanoicacid2EE,separation
引 言
二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是存在于海产鱼油中的ω23型多烯不饱和脂肪酸,具有重要的生理活性.在治疗和防治心脑
2002-07-02收到初稿,2002-08-16收到修改稿.
联系人:任其龙.第一作者:王宪达,男,23岁,硕士.基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(No1201092).
血管疾病、糖尿病、炎症以及抑制肿瘤等方面具有
较好的疗效.由于EPA和DHA位于鱼油中甘油酸酯的当中碳链上,所以要获得高纯度的EPA和DHA必须先将其从甘油酸酯中置换下来,通常采
用乙酯化[1].目前用于制备高纯EPA2EE和DHA2
Receiveddate:2002-07-02.
Correspondingauthor:Prof.RENQilong.E-mail:Renql@zju1edu1cn
Foundationitem:supportedbytheZhejiangProvincialNaturalSci2enceFoundation(No1201092).
第54卷第11期 王宪达等:超临界流体色谱法制备EPA2EE和DHA2EE・1559・
EE分离技术主要有有机溶剂萃取、真空蒸馏、尿
素络合、超临界萃取以及银离子络合等方法[2～6],而用超临界流体色谱法(supercriticalfluidchromatography,SFC)对其分离报道相对较少.SFC分离EPA2EE和DHA2EE具有独特的优越性,由于EPA2EE和DHA2EE在超临界二氧化碳中具有相当大的溶解度,故可用纯二氧化碳作流动相而无需加入极性改性剂,对产品不会造成有机污染,后处理简便,特别适合规模化制备生产纯EPA2EE和DHA2EE.此外,前人对鱼油脂肪酸酯和超临界,EPA2EE和DHA2EE[7～],流速、温度、流体色谱制备分离EPA2EE和DHA2EE的影响,为进一步扩大生产提供基础数据.
降温引起管路堵塞,高压微量调节阀用电热丝加热.
精制鱼油(EPA2EE和DHA2EE总含量53%)购自哈尔滨黑龙制药公司.二氧化碳购自杭州民星工贸有限公司,纯度为99199%.
色谱柱为Diamond52C18,250mm×416mm,购自DIKMA公司;82C18,250mm×10mm,外955020150购自 色谱条件
(100ml)-1的乙醇溶液,精制鱼油配成2110g・
μ进样量20l.在40℃,柱前压力分别为12MPa、14MPa条件下,考察流速对超临界流体色谱分离EPA2EE和DHA2EE的影响.在温度分别为35℃、45℃、55℃,压力为10～16MPa时,考察了最佳
1 实 验
111 仪器和试剂
制备温度和压力.
在最大上载量实验时,纯鱼油进样量分别为
μμμμ20l、40l、60l、100l.
考察进样浓度对分离影响时,进样浓度分别为
-1-1
1118g・(100ml)、2011g・(100ml)、4911g・(100ml)-1乙醇溶液及其1/3浓度,即3193(100ml)-1、617g・(100ml)-1、1614g・(100ml)-1的乙g・
醇溶液.未经溶剂稀释的鱼油和乙醇的体积比为1/3、2/3、2/5和3/5.
紫外检测波长为210nm.
实验装置的流程如图1所示.来自钢瓶的二氧化碳先经冰浴降温、液化,然后由带冷却泵头的高压计量泵加压,进入一个体积500ml的缓冲罐,稳定柱前压力.然后通过恒温水浴升温成为超临界流体(supercriticalfluid,SCF).超临界二氧化碳通过进样器溶解其中的样品后,进到色谱柱中进行分离.出柱后的二氧化碳直接进入高压UV检测器进行检测,并由色谱工作站记录处理色谱信号.出口通过一高压微量调节阀来调节流速.为了防止节流
Fig11 Schematicdiagramofsupercriticalfluidchromatographyequipment
1—CO2cylinder;2—flowcontrolpumpwithcoolingcylinder;3—surgetank;4—preheater;5—six2wayvalve;6—adsorptioncolumn;7—UVdetector;8—waterflask;9—soap2filmflowmeter;10—pressuregauge;11—filter;12—highpressureregulator;13—pressuresensor;14—pressuretransducer;15—
thermometer;16—temperaturecontroller;
17—heater;18—waterbath;19—chromatographicworkstation
・1560・化 工 学 报 2003年11月
2 结果与讨论
211 流速对分离度的影响
长.实测结果如表2.
Table2 ResolutionandretentiontimeofEPA2EEandDHA2EE
(feed20μ(100ml)l211g・
-1
ethanolsolution1
表1列出了40℃时EPA2EE和DHA2EE在柱前压为12MPa和14MPa时各个流速下,实验测得的超临界流体色谱分离度.流速以柱前状态为准.
Table1 FlowratedependenceofresolutionofEPA2EEand
DHA2EEat12MPaand14MPa
Pressure
/MPa12
Flowrate/ml・min-1
[***********][***********][***********]161597152
14
[***********][***********]181158197
Resolution[***********][***********][***********][***********][***********][***********]1163
6055Temp.
/℃35
Diamond52C18,250mm×416mmcolumn)
Precolumnpressure/MPa
10121612
Pressuredrop/MPa[**************]98
RetentionRetention
ResolutiontimeEPAtimeDHA
/min/min[**************]20
[***********][1**********]
[***********][1**********]
由表2可知,在55℃,12MPa时,明显比其他条件下的分离度高,这对提高产品纯度、增大每批操作的制备量都相当有利,当然比其他条件下的
出峰时间要长.考虑到提高温度对产品本身不利,且实验发现提高温度对分离没有明显的变化,如表3所示.而温度升高,为了达到同样的分离效果必须增大压力,对于工业生产而言,当然是温度越接近室温、压力越低越好.但是,压力不能太低,对
μm的色谱柱而言,其压降比较大,所以粒径为5
如果柱前压太小,必然导致柱后压更小,此时对鱼油的溶解度迅速下降,产品很难洗脱出来.
Table3 ResolutionandretentiontimeofEPA2EEandDHA2EETemp./℃55
Precolumnpressure/MPa
12131314
Pressuredrop/MPa[**************]3
RetentionRetention
ResolutiontimeEPAtimeDHA
/min/min[***********]
[***********]
[***********]95
由表1数据可知,实验范围内流速的变化对分离度的影响很小,而且没有显著增大或减小趋势.这是由超临界流体色谱的特殊性所决定的,在同一柱前压力下
,提高流速,导致出口压力下降,流动相整体密度下降.从热力学角度看,流动相密度下降,容量因子增大,分离度增大.从动力学角度看,存在一个最佳流速.两者作用的结果使得在实验范围内流速对分离度的影响没有明显的趋势.212 最佳制备温度和压力
213 上载量
由图2可看出,在250mm×416mm柱,纯鱼
μ油进样量达到20l时,可以得到很好的分离.当μ进样量增大到40l时,EPA2EE和DHA2EE之间的小峰已经无法分出,为了增大生产量,可以继续
加大进样量,通过切割色谱峰中的某一段得到目标产物来得到所需浓度的产品.
μm的250mm×10mm由图3可看出,对于8
柱,同样在12MPa、55℃条件下,其分离效果并
μm的250mm×416mm柱好.这是因为不比5
μm的250mm×10mm柱比5μm的250mm×8
由前期研究[7,10],可知较高的温度和较低的压力有利于分离,但温度的降低会导致出峰时间延
第54卷第11期 王宪达等:超临界流体色谱法制备EPA2EE和DHA2
EE・1561・
Fig12 Supercriticalfluidchromatographyfrompreparativefishoilethylestersinjections
atdifferentcolumnloads
(Diamond52C18,250mm×416mmcolumn;)pressue,12MPa;temperature,55℃
416mm柱粒径大,所以柱效差.同时,由于其粒
径大,于是压降小,对于同样的柱前压,其柱后压μm的色谱柱要大得多.所以,可通过降低柱比5
前压提高分离度.可以看出,在柱前压为11MPa时分离效果明显改善.随着进样量的增大,分离效
μ果变差.最大进样量约为100l.
研究还发现,当柱前压降到10MPa时其洗脱能力很差,如图4所示.实验开始时,柱前压力为11MPa,当EPA2EE出峰时程序降压[1MPa・(10min)-1]至10MPa,再程序升压[1MPa・(10min)-1]至11MPa,可以很好地分离EPA2EE和DHA2EE.当然在实际生产中,也可以通过升高压力使杂质峰快速洗脱出
.214 进样浓度对分离的影响由表4、表5可以看出,对52C18250mm×416mm柱,同样的进样量,浓度越高分离度越大.而对82C18250mm×10mm柱,不同的进样浓度对分离度几乎没有影响.这是由于溶解鱼油的乙醇在超临界二氧化碳中扩散,会导致色带变宽,同时高浓度进样可以减少进样时间,
所以鱼油完全可
Fig13 Supercriticalfluidchromatographyfrompreparativefishoilethylestersinjections
atdifferentcolumnloads
(Hyperprep82C18,250mm×10mm)column;temperature,55℃
・1562・化 工 学 报 2003年11月
μMPa,鱼油的最大上载量大于20l.对于82C18,250mm×10mm色谱柱,其相应的最适制备条件是
柱前压11MPa,温度55℃,压降约为015MPa,鱼
μ油的最大上载量约为100l.同时,进样浓度对分
离效果影响不大,鱼油无需溶解于溶剂而可直接进样.并且,可以通过程序升压和降压更好地分离EPA2EE和DHA2EE,产效率.
Fig14 Supercriticalfluidchromatographyfrom
preparativefishoilethylester(Hyperprep82C18,column;,;is
,onzalezC,JanttiM,AasltonenO1Purificationof
Polyunsaturated
Fatty
Acid
Estersfrom
Tuna
Oil
with
SupercriticalFluidChromatography.J1Am1OilChem1Soc1,
2000,77(3):315—3212 ZhaoYaping(赵亚平),WuShouyi(吴守一),ChenJun(陈
μfeed40l
1/3()oilethanolsolution)
钧),LiGuowen(李国文).State2of2ArtsofExtractionand
Table4 EffectofconcentrationonseparationofEPAandDHA
(Diamond52C18,250mm×416mmcolumn;
)pressure,12MPa;temperature,55℃
Pressuredrop
/MPa
[***********][1**********]02
Samplesize
/μl
[**************]0
Concentration
(100ml)-1/g・
[1**********]1fishoil(pur.)
[1**********]1/3fishoil(volume)
Resolution[***********][***********]1898
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Table5 EffectofconcentrationonseparationofEPAandDHA
(Hyperprep82C18,250mm×10mmcolumn;
)pressure,11MPa;temperature,55℃
Pressuredrop
/MPa
[***********]64
Samplesize
/μl
[1**********]0
Concentrationfishoil(pur.)
2/3fishoil(v/v)fishoil(pur.)2/5fishoil(v/v)3/5fishoil(v/v)
Resolution[***********]1201859
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Chinese
3 结 论
在实验范围内(52C18,250mm×416mm柱,
016～819ml・min-1)流速对分离度的影响不大.对于52C18,250mm×416mm色谱柱,其最适制备条件是柱前压12MPa,温度55℃,压降约为1