微生物基因工程育种技术的研究进展
国外医药抗生素分册2008年第29卷第5期
・193・
・药研动态・
微生物基因工程育种技术的研究进展
代云见,王明蓉,杜天飞
(中国医药集团四川抗菌素工业研究所,成都610052)
摘要:微生物基因工程育种是20世纪末发展起来的分子定向育种技术,该文重点概述了基因定点突变,易错PCR、DNA重排及基因组重排这几种微生物基因工程育种的基本原理和操作过程,并对这些方法的研究进展进行了扼要综述。
关键字:基因工程育种;基因定点突变;易错PCR;DNA重排;基因组重排中图分类号:Q789
文献标识码:A
文章编号:1000-8751(2008)05—0193—04
ProgressinStudyof
DAI
Microbial
GeneticEngineeringBreeding
Yun-jian,WANGMing—rong,DUTian—fei
(SichuanIndustrialInstituteofAntibiotics,ChinaNationalPharmaceuticalGroupCorporation,Chengdu610052,China)Abstract:Microbialgeneticengineeringbreedingis
atthe
a
molecular-directedbreedingtechnologythatwasdeveloped
on
endofthe20thcentury.Thisreviewpapermainlyemphasizes
the
basicprinciplesandoperationprocessesof
microbialgeneticengineeringbreedingincludingsite・directedmutagenesis,error-pronePCILDNAshufflingandgenomeshuffling.Additionally,theprogressintheresearchofabove-mentionedmethods
Keywords:geneticengineeringbreeding;site-directedmutagenesisshuffling
or
technology
isalsosummarized.shuffling
l
error-pronePCR;DNAgenome
基因工程是20世纪70年代发展起来的一种新型生物技术,其发展从根本上改变了生物技术的研究和开发模式。利用这些技术,可以直接地、有针对性地在DNA分子水平上改造生物的遗传性状。通过转入外源基因,微生物和动、植物细胞可以产生出自身原来没有的蛋白质。同样,利用重组DNA技术,也可以使一些原来存在量极低但有重要工业或医学用途的小分子(抗生素)或蛋白质之外的大分子物质得以大量生产。特别是随着重组
技术主要有如下几种。1.1基因的定点突变
定点突变(site—specificmutagenesis或site—directedmutagenesis)是指在目的DNA片断(例如:一个基因)的指定位点引入特定的碱基对的技术,其包括寡核苷酸介导的定点突变、盒式诱变以及以PCR为基础的定点突变。基于PCR的定点突变技术由于其突变效率高、操作简单、耗时短、成本低廉等优点而倍受关注。因此,近十年来,定点突变技术获得了长足的发展,并且在此基础上又发展了很多新技术。例如:重叠延伸PCR法(Overlap
Extension
DNA技术的完善和发展,以基因水平为核心的现代分子
定向育种技术越来越受到工业微生物育种学家的关注,并展示了良好的应用前景。本文就目前工业微生物育种领域中主要基因工程育种技术的研究进展作一综述。1基因工程育种
基因工程育种【l】是以分子遗传学的理论为基础,综合分子生物学和微生物遗传学的重要技术而发展起来的一门新兴应用科学。基因工程技术的全部过程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段与基因载体的体外连接、外源基因转入宿主细胞和目标基因的表达等主要环节。近年来出现的运用基因工程进行定向育种的新
收稿日期:2008.07.01
作者简介:代云见,硕士,主要从事分子育种技术研究。
PCR简称EO-PCR)、大引物PCR
法(MegaprimerPCR)、一步重叠延]@PCR(One・step
OverlapExtension
PCR,简称OOE—PCR)、单管大引物
Amplificationof
PCR(Single—tubeMegaprimerPCR)、快速定点诱变法、
多位点环状诱变法和TAMS(Targeted
MutantStrand)定点诱变技术。在这些技术中,单管大引
物PCR和TAMS定点诱变技术最为简单和适用,并得到广泛的应用。
1.1.1单管大引物PCRPicard等【2]币llKe掣3】分别建立了单
万方数据
管大引物PCR法。该法省去了传统上以PCR为基础的定点突变中第1轮PCR产物的纯化过程,实现了在同一管中先后进行2轮PCR反应的定点突变目标。在上述2组研究者建立的方法中,后者提出的方案更加巧妙、简单(图1)。其只需设计Tm值不同的2个侧引物,在第l轮PCR反应中用Tm值低的侧引物(F1)和诱变引物,在较低的退火温度下进行扩增反应,产生大引物;然后再加ATm值高的侧引物(F2),在较高的退火温度下进行第2轮反应,扩增出含突变位点的整个DNA产物。Ke等在此方法中还提出了2条更为细致、有效的改进措施,使PCR产物的最终产量和纯度均有所提高。这2条改进措施为:(1)在第1轮PCR反应中,诱变引物的浓度仅为侧引物的1%,以减少诱变引物在第2轮PCR中的干扰作用;(2)在第1轮PCR反应后,亦即第2轮PCR反应前,增加5个循环的不对称扩增,这有利于提高其后的扩增效率。这种单管大引物法的优点是:实现了在同一管中先后进行2轮PCR反应,大幅简化了操作步骤,并且省时、省力。在对多个样品进行操作时,该方法的优点更为突出。在以PCR为基础的诱变方法中,该法是引入单位点突变最简单、最经济的方法。
1.1.2
TAMS定点诱变技术2003年,Young掣4]报道了
一种有目的地扩增突变链的定点诱变技术(Targeted
amplificationofmutant
strand,TAMS)。该技术能够一次
引入多个位点的突变,并且能够有目的地扩增突变链,从而使突变效率几乎达到100%。该方法主要分3步(图2):(1)线性单链DNA模板的制备:通过线性PcR制备单链DNA模板;(2)突变链的合成:该步骤需用2个锚锭引物
诱变引物
●◆
3’————————■————;5’
(低退火温度’’.L-产生I轮大P引CR物F1
5’-●-----------—・・-———---一37
3’—卜—————————一5’
。,坚
大引物
±
门,
3’————Z======昏
‘高退火温度’山第2轮PcR
5’-—---・-—--—--・-----—-●-----—・-—・-—-——--3’
3’——-—-—-—————————__卜—————-——-—一5’
突变的全长DNA图1单管大引物PCR过程
Figure1TheprocessofSingle—tubemegaprimerPCR
万
方数据WorldNotes
on
Antibiotics,2008,V01.29,No.5
(即Anchor5和Anchor3)和多个诱变引物(Muti年llMut2)。首先在多核苷酸激酶的作用下使每个引物都磷酸化,接着在DNA聚合酶的作用下使引物与线性模板退火、延伸,最后在DNA连接酶的作用下合成突变链。其中,2个锚锭引物在目的基因序列外,与载体的序列互补,并分别引入1个突变位点(该突变位点是有目的地扩增突变链的基础)。该步骤采用的退火温度是变化的、广范围的[把反应体系置于含lL水(75℃)的广口杯中,置室温渐冷至37"C],以保证其能满足所有引物,提高突变效率。(3)有目的地扩增突变链:设计扩增引物(PCR5和PCR3),使其
3
7端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对,扩增引
物只能退火到突变链而不是亲本链。这个方案基于这样一个事实,即只有引物37端碱基完全与DNA配对,DNA才能得到有效的扩增。所以在此方案中只有突变链才能扩增。TAMS诱变技术不仅可以同时引入多个突变位点,而且因采用了渐进改变且广范围的退火温度,并且能有目的地扩增突变链,因此突变效率很高,几乎达到100%。另外此法也可用于单链cDNA的诱变。所以,在多位点的突变试验中,TAMS诱变技术应该是首选方法。
定点突变技术已在蛋白质的结构和功能改造上取得了很大成功。例如,利用定点突变改变酪氨酰.tRNA合成酶的活性中心,从而使酶活力提高了50倍;此外,在T4溶菌酶中加入二硫键,显著提高了该酶的稳定性。1.2易错PCR
DNA聚合酶在进行扩增目的DNA时会以一定的频率发生碱基错配,这一现象恰好提供了一种对特定基因进行随机诱变的可能方法。利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因随机诱变的技术就称为易错
PCR(Erro卜pronePCR,简称EP—PCR)t51。此方法的原理
.‘∈_—-一.苣—L一{r_o●}-
山线。]生PCR
Anchor5’
Mut1
Mut2
Anchor3’
l延伸和连揍
山
图2TAMS定点诱变技术原理和操作过程
Figure2TheprincipleandoperationprocessofTAMS
国外医药抗生素分册2008年第29卷第5期
‘err。r—pr。ne
pcR
粕
胤
・—・≮——_'尸・・・_',l突变基因
'・_—_・_————_—・——_‘・・・・_一II-(:l:突变)
____——二——_—・_L正突变基因
广
'■■■■■■————■——●■—●●●■■■■■-…’一
图3易错PCR示意图
Figure3Sketchoferror-pronePCR
与操作如图3,其操作过程是在TaqDNA聚合酶催化的PCR反应体系中,利用Mn2+替代天然的辅助因子M92+,使TaqDNA聚合酶缺乏校对活性,同时使反应体系中各种dNTP的比例失衡,因此导致碱基的错配率大大增加,通常约为0.1%。另外,还可以在该反应体系中加入dlTP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平。这种方法可以将错配率最大提高至20%。从易错PCR的操作过程可以看到,此法与传统诱变育种技术之间的最大差别就在于,前者是基因水平上的随机突变操作,而后者则是细胞水平上的随机诱变技术。此外,易错PCR.一般只产生点突变,因此其产生的突变体在多样性方面尚有一定缺陷。但作为一种能够从单一基因产生丰富的随机突变体
的技术,易错PCR仍有广泛的应用领域。孔荣掣6】利用易错PcR使D一海因酶对底物的水解活性提高了2.4倍;黄瑛
等【7】用易错PCR使短小芽孢杆菌Yz02脂肪酶活性提高了1.3l倍,Km值由8.24mmol/L降低至7.717mmol/L,在pH>8.0时的稳定性也较野生型脂肪酶有所提高。
1.3
DAN重排
DNA重排(DNAshuffling)技术是一种利用重组文
库的体外定向进化技术,由Stemmert8】于1993年首先提出。DNA重排的基本原理是首先将同源基因(单一基因的突变体或基因家族)切成随机大小的DAN片段,然后
进行PCR重聚。那些带有同源性和核苷酸序列差异的随
机DAN片段在每一轮循环中互为引物和模板,经过多次PCR循环后能迅速产生大量的重组DNA,从而创造出新基因。其操作的原理和步骤如图4。
Zhao等【91在此基础上发明了_一种更加简化的DNA重排技术,即交叉延伸程序(Staggered
ExtensionProcess,
万
方数据・195・
●阳性突变表型。O阴性突变表型图4DNA重排的原理及操作步骤
Figure4TheprincipleandoperationprocessofDNAshuffling
相关的DN嫁族一
特定引物延伸…
亡==========了
短暂的聚合/变性反应
一■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■-
中小片段DNA台成口
亡======:==]
重复上述过程I
PCR台成的、Jl,旷
随机改变梗板口—口
DNA片段
一
并进一步延伸亡=====了匕=====]
重复上述过程;
因时,分离全长基因并用基一
芒=!=!!!o
V
当PCR片段大小揍近全长基_—r———r—_
因外引物扩增全长基因。亡!=:!=!=j
芒1211=!==3
图5交叉延伸程序的基本过程
Figure5Basicprocedureofstaggeredextensionprocess
近几年来,提高DNA重排技术捕获变异的能力
STEP)(图5)。此技术是在一个PCR反应体系中以2个以上相关的DNA片段为模板进行PCR反应。引物先在一个模
板链上延伸,随之进行多轮变性、短暂复陛(延伸)过程。
在每一轮PCR循环中,那些部分延伸的片段可以随机地与含不同突变的模板进行杂交,使延伸继续,并由于模板转换而实现不同模板间的重组,这样重复进行直到获得全长基因片段,重组的程度可以通过调整时间和温度
来控制。此方法省去了将DNA酶切成片段这一步,致使
DNA重排方法进一步简化。
・196・一直是研究人员努力的方向。Ostermie等¨0]以核酸外切酶Ⅱ代替DNaseI对靶序列进行消化,发明了递减法
建立杂交酶技术(Incremental
TruncationforCreation
ofHybrid
Enzymes,ITCHY),使得非同源性序列间
也能发生重排,扩大了该技术的用途。Hiraga等…3开发的SISDC(Sequence・independent
Site—directed
Chimeragenesis)技术在组件内部引入了限制性内切酶识别标记,用相应的限制性内切酶代替DNaseI产生重排片段。这项技术突破了重排基因同源性较高(约70%)的限制,在仅;fi'49%序列同源性的亲本链之间实现重排,利用人为的定向酶切连接赋予DNA重排体系抗同源的性质,拓宽了可利用的差异基因的来源。Bergquist等【12】开发的DOGS(Degenerate
OligonucleotideGene
Shuffling)
技术则是根据保守模体区序列特征设计简并引物,扩增出保守同源区后再用重排操作生成突变富集体。由于此方法是在突变耐受的保守区直接增加转辙组的几率,所以其产生的突变频率大大增加。
DNA重排的最大特点是在反复突变过程中引进了重组这一自然进化中最重要的过程,而且其对可操作的靶序列的长度没有任何要求,可以达到几万kb。通过多轮筛选或选择,可以使有益突变迅速积累,导致功能的明显提高,同时还打破了传统物种之间由于生殖隔离导致不能重组的界限。由于可以产生丰富的重组突变体文库,因此该技术已经在许多领域得到广泛应用,其中包括:用于改善生物分子的活性和稳定性,在非天然环境下改善蛋白质的活性和稳定性,开发酶抑制剂,提高抗生素抗菌活性或开发抗生素新功能,扩大酶作用的底物范围及改变底物特异性,发现新型疫苗和药物分子,提高抗体亲和力,以及开发新的代谢途径等。1.4基因组重排
基因组重排(genomeshuffling)技术是受DNA重排的启发,于21世纪出现的全基因组改组技术。这种技术将分子定向进化的对象从单个基因扩展到整个基因组,可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。首先,利用经典的诱变育种技术获得含有目标性状的基因组库,然后利用原生质体融合技术将这些发生正向突变的菌株的全基因组进行多轮随机重组,从而快速筛选表型得到较大改进的杂交菌种。该技术巧妙地采用了多轮循环原生质体融合技术(即将各种亲本制成原生质体一融合一再生一再制成原生质体一融合一再生),即递归原生质体融合(recursive
protoplast
fusion)的方法。与DNA
重排技术相比,该法的最大特点是不必了解菌株的遗传背景,在细胞水平上即可进行定向进化。Zhang等【131于2002年首次报道应用基因组重排方法快速地使弗氏链
万
方数据WorldNotes
on
Antibiotics,2008,V01.29,No.5
霉菌(Streptomycesfradiae)产生泰乐菌素的能力得到提高。该方法以营养缺陷型为出发菌株,仅用了1年时间,通过两轮基因组改组就从24000株菌株中分离到2组共14株泰乐菌素高产菌株,其泰乐菌素产量高于通过经典诱变育种方法所筛得的生产菌株SF21,而后者(SF21)是用经典诱变育种方法在长达20年的时间中先后筛选过约
1000
000个菌株后才获得的。由此可见,此技术大大减
少了工作量,并缩短了筛选时间。四川抗菌素工业研究所的徐波等[14】以产量性状为标记特征,应用基因组重排的方法在一年之内使替考拉宁产量提高了65.3%。
基因组重排技术在人们对微生物的遗传特性尚未完全掌握的今天可快速实现基因的突变与筛选,其有可能成为现代工业微生物育种的一种有效手段。有学者预言:“基因组重排技术的建立和成熟将引起传统微生物育种以及发酵生产的一场革命f15]"。
除上述技术外,近年来又出现了一些新技术,例如:
部分基因片段改组、单链DNA家族改组(SSDNAs)、简
并引物基因改组(DOGS)、瞬时模板的随机嵌合(random
chimeragenesis
on
transient
templates)、单向引物的随机
重组(mutagenic
andunidirectional
reassemble)、自我复制
(compartmentalizedself-replication)、体外随机引发莺组(random—priming
invitrorecombination
RPR)、酶法体外
随机.定位诱变(random.site.directedmutagenesis)、交错延伸剪接PCR等。本文不再逐—加以介绍。2展望
基因工程自20世纪70年代问世以来便受到了全世界的广泛关注,并得到了飞速发展,特别是在微生物分子育种方面取得了巨大的成功,重组人胰岛素的上市就是第一个例证。随后又陆续应用基因工程技术对各种微生物的性状进行了改造,使目标代谢产物的产量得到大幅提高,并实现了工业化生产,如酶、维生素、氨基酸、激素、促红细胞生长素等。随着生物化学、遗传学、分子生物学以及各种生物技术的发展,基因工程育种必将取代传统育种,使微生物各种代谢产物快速产业化,以满足人类日益增长的需求。
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(下转第200页)
WorldNotesonAntibiotics,2008,V01.29,No.5
赖最初的药物选择,而是要对患者的病情进行认真的监测。如若在基因型耐药阶段就检测到病毒的耐药性,应增加一种容易对病毒产生再抑制的补救药物。但是,如果治疗是在发生临床突破时才开始的,则达到病毒抑制的难度要大得多。应该避免相继采用NAs单一疗法,因为已证实其可选择性诱导多药耐药突变株的产生。
对患者的病情进行适当的监测是担保获得足够的应答反应和避免耐药突变株出现的唯一途径。尽管治疗费用是大家普遍关注的问题,但却极少讨论到监测费用。然而,实验室检测费用在整个花费中占有相当的比例。通过对足量的监测结果进行综合分析可获得灵敏、精确的HBV-DNA定量分析结果。只对ALT水平进行跟踪监测是不够的。尽管每个药物治疗所产生的效能各不相同,但应该至少每隔3个月进行1次HBV・DNA检测直至病毒被完全抑制。对HBV—DNA的频繁检测可了解患者
表3对NA抗病毒耐药性的定义
耐药类型
定义
的治疗依从性以及药物的疗效。对有获得最适度以下治疗应答风险的患者应进行早期鉴别,以便及早修正治疗方案。若未见任何应答反应或病毒反弹,则必须对患者进行耐药性基因型检测。对于初始HBeAgIj日性患者,应在治疗期间每隔24周检测1次HBeAg年N抗一HBe。若患者的HBeAg保持阴性且HBV-DNA水平低于检测下限,则应该每隔6-12个月检Hql次HBsAg。某些人还提倡进行
基线基因型检测,这虽然不是什么执行标准,但其可以
鉴别出基线耐药突变以及很可能对IFN—o【/PEG产生应答反应的基因型A感染者。除了药物选择或应答反应外,另一个非常重要的方面是对HBV携带者,特别是那些来自非洲、亚洲或已发生肝硬化的患者进行肝癌监测。6结语
在最近几十年中,对乙型肝炎的控制和治疗取得了长足进展,但是所建立的治疗方案仍然是以达到病毒抑制(而不是病毒根除)、避免发生主要肝病后遗症为其奋斗目标。由于相当多的患者可能需要接受终生治疗’故在选择治疗方案时需着重考虑药物的安全性和耐药性。从对病毒感染的治疗到对病毒进行长期的抑制这一变更的全过程都不能脱离对患者的仔细监测和为降低耐药风险而采用的联合疗法。随着新研究成果的发表,我们也可能考虑对单纯依据病毒载量和基因型风险而确定的患者根据其年龄、ALT水平、组织学平llHBeAg状态更换治疗候选药物。
基因型耐药在HBV基因组内发生突变,最终会导致药物敏感性丧
失;若不改变治疗方法,病毒通常会从基因型耐药发展为病毒学耐药。
病毒学耐药在出现基因型耐药后,随之发生血清HBV-DNA水平反
弹,病毒学耐药率的大小取决于所用HBV-DNA检测方法的灵敏度以及对病毒学反弹的定义[通常比最低值高出(1~2)logs]。
临床耐药
伴随ALT水平升高或组织学病变而发生的病毒学突破。
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