高效液相色谱_质谱联用测定胶原蛋白中的羟脯氨酸_夏金根
2008年9月September2008
色谱
ChineseJournalofChromatography
Vo.l26No.5
595~598
高效液相色谱-质谱联用测定胶原蛋白中的羟脯氨酸
夏金根, 陈 波, 姚守拙
(化学生物学及中药分析教育部重点实验室湖南师范大学,湖南长沙410081)
摘要:建立了一种简单、快速地测定胶原蛋白中羟脯氨酸(HYP)的高效液相色谱-电喷雾质谱(HPLC-ESI/MS)方法。胶原蛋白经酸水解后,以乙腈-0105%的三氟乙酸水溶液(体积比为5B95)为流动相,以110mL/min的流速在C8反相柱上进行分离。以茶氨酸为内标,利用质谱定性定量测定HYP。在电喷雾正离子模式下,对m/z132和m/z175离子进行选择离子监测。在1117~117mg/L范围内,HYP与内标物茶氨酸的峰面积比和HYP的质量浓度呈良好的线性关系,相关系数为019993。含量测定的相对标准偏差为1187%,回收率为97185%~101176%。此方法流动相简单,分析时间短且无需衍生处理,抗干扰能力强,能准确快速地测定胶原蛋白中HYP的含量。关键词:高效液相色谱-质谱;羟脯氨酸;胶原蛋白
中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:1000-8713(2008)05-0595-04 栏目类别:研究论文
Determinationofhydroxyprolineincollagenousproteinsbyhigh
performanceliquidchromatography-massspectrometry
XIAJingen,CHENBo,YAOShouzhuo
(KeyLaboratoryofChemicalBiologyandTraditionalChineseMedicineResearchofMinistry
ofEducation,HunanNormalUniversity,Changsha410081,China)
Abstract:Asimple,rapidandaccuratemethodforthedeterminationofhydroxyprolineinco-llagenousproteinsbyhighperformanceliquidchromatography-electrospraymassspectrometry(HPLC-ESI/MS)wasdeveloped.Afterhydrolysisofcollagenousproteinswithhydrochloricacid,thehydroxyprolinewasseparatedonaSpherigelC8columnusingacetonitrile-0105%trif-luoroaceticacidaqueoussolution(5B95,v/v)ataflowrateof110mL/min.Theaninewasusedastheinternalstandardforthequantification.Hydroxyprolinewasidentifiedandquant-ifiedbyelectrosprayionizationmassspectrometry(ESI-MS),whichwasoperatedinpositive
ionmodewhilethem/z132andm/z175ionswererecordedintheselectiveionizationmonito-ring(SIM)mode.Thepeakarearatioofhydroxyprolinetotheanineversusthehydroxyprolineconcentrationwaslinearoveraconcentrationrangeof1117-117mg/Lforhydroxyproline.Thecorrelationcoefficientwas019993.Thereproducibilityandaveragerecoveryofthemethodwere1187%and98185%respectively.Themethodhastheadvantagesofeasyoperation,with-outderivatization,lessanalysistime,goodprecisionandaccuracy.
Keywords:highperformanceliquidchromatography-massspectrometry(HPLC-MS);hydroxyproline;collagenousproteins 羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)是一种亚氨基酸,通常在脯氨酸的第4位上带有羟基(见图1),但有时也在第3位上。HYP是胶原蛋白的主要组成成分,不属于20种常见的氨基酸
[1]
量,从而确定胶原蛋白的总体水平
[2]
。
。HYP约占
图1 4-羟脯氨酸的结构式
Fig.1 Structureof4-hydroxyproline
胶原蛋白中氨基酸总量的10%,而在其他蛋白质中
含量甚微,这使得它几乎成为胶原蛋白所特有的成分,因而可通过测定HYP含量来计算胶原蛋白的含
收稿日期:2007-12-30
第一作者:夏金根,硕士研究生.Te:l(0731)8865515,E-mai:[email protected]. 波.Te:l(0731),E-mai:[email protected].
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色
[3,4]
谱第26卷
羟脯氨酸的传统测定方法是氯胺T法,其基本原理是:先把含有HYP多肽的蛋白质、组织、血清、腹水或尿液等水解成游离的HYP,游离的HYP被氧化后再与对二甲氨基苯甲醛(PDAB)在一定温度下发生反应,生成红色的吡咯化合物,最后通过分光光度计比色或其他的方法检测出水解液中HYP的含量。氯胺T法的特异性差,灵敏度低,影响因素较多,目前研究及应用的已不多。
近年来,柱前衍生高效液相色谱法测定HYP的报道较多,但衍生步骤比较繁琐,衍生条件限制较多
[5,6]
1.2.2 质谱条件
离子源:ESI,电喷雾离子化正离子采集模式(ESI);质量扫描范围:40~300u;毛细管电压:315kV;锥孔电压:25V;萃取电压:410V;射频电压:015V;源温度:103e;脱溶剂温度:300e;脱溶剂气速度:280L/h;锥孔反吹气速度:60L/h;选择离子监测模式(SIM),选择离子为m/z132和m/z175。1.3 标准溶液的配制
精密称取5815mgHYP标准品于50mL容量瓶中,加水溶解定容,得1117g/L的标准储备液。精密称取2011mg茶氨酸标准品于50mL容量瓶中,加水溶解定容,得01402g/L的内标物溶液。精密吸取不同体积的标准溶液,加入相同体积的内标物溶液,适量稀释至HYP的质量浓度分别为1117,29125,5815,87175和117mg/L的标准系列溶液(其中内标物茶氨酸的质量浓度为8014mg/L)。1.4 样品处理
取胶原蛋白美容胶囊5粒,去壳、混匀,精密称取010520g,加6mol/L盐酸-015%苯酚溶液10mL,真空封管,于110e下水解24h,挥干溶剂
[9,10]
+
,而且影响检测的准确性,从而限制了其发展
前景。另外,也有在200nm波长下直接检测出氨
[2]
基酸的报道,但检测灵敏度较低,杂质峰干扰较大。与其他技术相比,高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC-ESI/MS)可以提供丰富的结构信息,显著提高了检测的准确度、灵敏度,操作简单。但利用HPLC-ESI/MS技术测定胶原蛋白中HYP含量的文献报道甚少。我们采用此法测定了胶原蛋白中的HYP,充分利用了液相色谱的分离能力和质谱的定性定量能力,节省了样品的处理时间和分析时间。
[7,8]
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Waters2695分离单元,配有自动进样器;Wa-tersMicromassZQ2000质谱检测器,配有电喷雾电离源(ESI);AL204电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);MTN-2800D型氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。
L-羟脯氨酸标准品(纯度\9815%,杰辉生物技术有限公司),L-亮氨酸标准品(纯度\9810%,上海源聚生物科技有限公司),L-异亮氨酸标准品(纯度\9810%,天津市光复精细化工研究所),L-精氨酸
标准品(纯度\9815%,杰辉生物技术有限公司),茶氨酸标准品(纯度\9910%,进口);胶原蛋白美白胶囊(广东威士雅保健品有限公司);三氟乙酸(进口),乙腈、甲醇为色谱纯,盐酸为分析纯;纯净水用Millipore公司的Mill-iQ纯水系统(Bedford,MA)制得。
1.2 液相色谱-质谱条件
1.2.1 液相色谱条件
色谱柱为SpherigelC8柱(200mm@416mm,5Lm,大连江申分离科学科技公司);流动相为乙腈-0105%三氟乙酸水溶液(体积比为5B95),流速为110mL/min;柱温为室温;进样体积为10LL,以01m,加水溶解,加入内标物溶液5mL,加水定容
至25mL,过0145Lm纤维素微孔滤膜,滤液直接
进高效液相色谱/质谱仪检测。
2 结果与讨论
2.1 流动相和内标物的选择
胶原蛋白水解之后生成多种氨基酸,其中亮氨酸和异亮氨酸的相对分子质量(Mr)与HYP的M
r
都为131,其准分子离子峰m/z都为132,故需排除以上两种氨基酸的干扰。本文分别采用不同比例的乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0105%甲酸水溶液、乙腈-0105%三氟乙酸水溶液对HYP(50mg/L)、亮氨酸(50mg/L)和异亮氨酸(25mg/L)标准溶液进行等度洗脱,意在对这3种氨基酸进行色谱分离,消除干扰。结果表明,当流动相为乙腈-水、乙腈-0105%甲酸水溶液和乙腈-0105%三氟乙酸水溶液(体积比均
为5B95)时,上述3种氨基酸均能达到基线分离。流动相为乙腈-0105%三氟乙酸水溶液(体积比为5B95)时上述3种氨基酸的SIM色谱图见图2。
质谱多采用内标法进行定量测定。茶氨酸是茶叶中特有的游离氨基酸,不存在于胶原蛋白中,因此本实验选用茶氨酸作为定量内标。同时,考虑到样品水解液中可能存在精氨酸,而精氨酸的Mr与内标物茶氨酸的Mr均为174,其准分子离子峰m/z
第5期
夏金根,等:高效液相色谱-
质谱联用测定胶原蛋白中的羟脯氨酸
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和35V的锥孔电压下HYP的响应信号。结果表明:锥孔电压为30V时,HYP的响应值达到最大;超过30V后,其响应信号反而减小,碎片离子增加。适当调节其他质谱条件进一步优化,最后确定了/112120节所述的质谱条件。
在优化的质谱条件下,HYP标准品(50mg/L)的质谱图见图4-a,m/z132为其准分子离子[M+H]。茶氨酸标准品(80mg/L)的质谱图见图4-b,
+
m/z175为其准分子离子[M+H]。
图2 (Ñ)羟脯氨酸、(Ò)亮氨酸和(Ó)异亮氨酸的
选择离子m/z132的质量色谱图Fig.2 Masschromatogram(m/z132)of
(Ñ)hydroxyproline,(Ò)leu-cineand(Ó)isoleucine
+
流动相对茶氨酸(80mg/L)和精氨酸(50mg/L)进行洗脱,发现当流动相为乙腈-0105%三氟乙酸水溶液(体积比为5B95)时,茶氨酸与精氨酸能达到较好
的分离(见图3)
。
图3 (Ñ)精氨酸和(Ò)茶氨酸的选择离子
m/z175的质量色谱图Fig.3 Masschromatogram(m/z175)of
(Ñ)arginineand(Ò)theanine
图4 (a)羟脯氨酸和(b)茶氨酸的选择离子质谱图
Fig.4 SIMmassspectraof(a)hydroxyproline
and(b)theanine
胶原蛋白水解后主要含有各种氨基酸,用质谱
定性定量检测HYP时,只需考虑与其Mr相同的氨基酸,其他氨基酸的影响很小。每次样品处理完后,用3~4倍柱容量的乙腈-0105%三氟乙酸水溶液(体积比为90B10)冲洗色谱柱,使其回到初始条件,避免非极性物质对色谱柱及质谱检测器的影响。2.2 质谱条件的优化
为了得到HYP的最佳质谱响应,提高其灵敏度,实验中利用流动注射法(flowinjectionanaly-sis,FIA)对其质谱参数进行优化。由于HYP的结构中既有亚氨基又有羧基,因此正离子模式和负离子模式下都应有较好的响应。但经过实验比较,发现其在正离子模式下的响应更好。根据各质谱参数对HYP响应和裂解方式的影响情况,主要对锥孔电
2.3 线性关系、检出限和定量限
对加有内标的一系列浓度的HYP标准溶液进
样检测,每个浓度的试样平行分析3次,用HYP与茶氨酸峰面积比的平均值(Y)对HYP质量浓度(X,mg/L)做标准曲线,得到线性方程:Y=01027X-01011,r=019993;线性范围为1117~117mg/L。 将HYP标准溶液逐级稀释后,测得最低检出限为017Lg/L(S/N=3),最低定量限为213Lg/L(S/N=10)。2.4 重现性实验
平行称取样品粉末5份,按/1140节方法进行处理后测定,HYP含量测定结果的相对标准偏差(RSD)为1187%。2.5 加样回收率试验
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30mg(其中HYP的质量分数为3163%,约为111mg)。分别加入117mg/LHYP标准溶液5,10,15mL,按/1140节所述处理后进行回收试验。每个试样平行处理5份,可得低、中、高加标水平下的平均回收率(n=5)分别为9815%(RSD=1123%),9719%(RSD=1192%)和10118%(RSD=2101%)。
2.6 样品分析
内标物茶氨酸(80mg/L)的选择离子(m/z175)的质量色谱图见图5-a。实际样品(HYP的质量浓度约为75mg/L)和加内标(茶氨酸的质量浓度约为80mg/L)后该样品的选择离子(m/z132,175)的质量色谱图分别见图5-b和图5-c
。
图5 (a)茶氨酸的选择离子(m/z175)、(b)实际样品的选择离子(m/z132,175)和
(c)添加内标的实际样品的选择离子(m/z132,175)的质量色谱图
Fig.5 SIMchromatogramsof(a)theanine(m/z175),(b)arealsample(m/z132,175)
and(c)thesamplespikedwiththeamine(m/z132,175)
1.hydroxyproline;2.arginine;3.theanine.
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3 结语
本文采用高效液相色谱-质谱联用的方法测定胶原蛋白中HYP的含量。该方法的流动相简单,分
析时间短,且无需对样品进行衍生,操作简便,定量准确,重现性好,抗干扰能力强,可以用于实际样品的测定。参考文献: