高产谷氨酸产生菌的工艺研究

高产谷氨酸产生菌的工艺研究

Study on technology of high yielding glutamic acid producing strains

13生工杨雅娴

前言工业发酵研究和开发的主要目标之一是建立一种能实现高产、低成本的可行过程，生产条件优化是改进现有菌种产量的重要方法。本文对发酵法生产谷氨酸的试验流程进行优化，探讨发酵生产过程中的关键影响因素，发现谷氨酸发酵生产中，溶解氧水平是发酵生产的限制瓶颈，也是得到高产谷氨酸的关键因素之一。因为低溶氧更有利于产乳酸，乳酸产量增加将直接导致谷氨酸产量减少。试验以糖质原料为出发，结合谷氨酸产量跟踪，确定了菌株由“生长型”转化为“生产型”的时间，从而确定了“分瓶”培养的方法。发酵前期注重菌体的生长培养，发酵后期减少液体量以增大溶解氧来进一步提高谷氨酸产量。通过这种培养，得到一套较为完整的谷氨酸摇瓶发酵的方案。同时，对发酵过程中培养基及培养条件进行优化，得到较好的谷氨酸产量。

Industrial fermentation research and development one of the main objectives is to establish which can realize high yield, low cost feasible process, optimization of production conditions is important for improved strains of existing production methods. This article to optimize the testing process of the glutamic acid production by fermentation, explores the key influencing factors of fermentation found in glutamate fermentation, the level of dissolved oxygen is the limit of production bottlenecks, is also one of the key factors of high yielding glutamic acid. Due to low dissolved oxygen is more conducive to production, will lead directly to an increase in production of glutamic acid production of lactic acid. Experiments with sugar raw material based on the combination of glutamic acid production tracking, strains were determined by "growing" into "production" time, so as to determine the "bottle" method of training. Fermentation early focus on bacterial growth, late fermentation to further reduce the amount of liquid to increase dissolved oxygen increasing glutamic acid production. Through this training, get a more complete fermentation of glutamic acid solution. Same time, to optimize fermentation culture medium and culture conditions, get a better production of glutamic acid.

一、谷氨酸棒杆菌的诱变选育

1.1 试验方法

1.1.1菌种纯化谷氨酸棒杆菌 W3 平板（完全培养基）划线分离。32 ℃，培养 24～30 h，挑取单菌落，继续纯化培养，如此反复三次，保证菌落纯后保藏。

1.1.2菌种保藏用斜面保藏培养基，4 ℃保藏。 2.3.3 斜面活化 W3 菌株(分离纯化后)接入斜面培养基，32 ℃培养 24 h。

1.1.3种子液摇床培养条件 32 ℃，200 r/min。 2.3.5 种子培养取活化菌种两环接入装有 30 m L/250 m L 种子培养液的三角瓶中，摇床培养 16 h。

1.1.4.1紫外诱变处理

（1）菌种活化

（2）菌体前培养：取活化菌种接入种子培养基，种子培养至对数期，然后以5 %的接种量转接至相同的种子培养基培养至对数期，下摇床，置于 4~6 ℃低温静置 2 h，低温诱导菌体同步生长后，取出放至室温，以 20 %的接种量转接至新鲜的种子培养基，培养 2~3 h，使细胞处于同步生长状态备用。

（3）紫外诱变处理：取同步生长的种子液，以0.85 %的生理盐水稀释至10-7，取5 m L稀释液加到直径9 cm培养皿中，于磁力搅拌器上搅拌并放置于15 W紫外灯下30 cm处，开启皿盖搅拌照射不同时间。此过程在红光下操作，以免光复活作用影响诱变效果。

诱变结束后用移液枪吸取0.2 m L涂布于筛选培养基。

1.1.4.2亚硝酸钠诱变处理[50] 取0.2 mol/L的亚硝酸钠溶液1 ml加入大试管中，加入1 ml同步生长状态下的种子液，立即加入1 m Lp H 6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，充分混合后，置27 ℃水浴，诱变不同时间，以选择致死率达80 %的作用时间。加0.07 mol/L p H 8.6 的Na2HPO4溶液2 ml，终止反应。 2.3.8 筛选方法 2.3.8.1 营养缺陷型的平板筛选取诱变菌液0.2 m L涂布到基本培养基与添加了适量Glu的基本培养基中，32 ℃培养2 d，对照平板，选择基本培养基中不生长而添加Glu培养基中生长的菌落分离纯化，保藏。

1.2谷氨酸营养缺陷型回复突变株及天冬氨酸渗漏性突变株平板筛选

（1）谷氨酸营养缺陷型回复突变株平板筛选取适当的诱变菌液0.2 m L涂布到基本培养基中，32 ℃培养2 d，选取生长的菌落，分离纯化，保藏。

（2）天冬氨酸渗漏性突变株的平板筛选取适当的诱变菌液0.2 m L涂布于基本培养基与添加少量Asp的基本培养基中，32 ℃培养2 d，选取在基本培养基中生长的菌落较小，而在添加了天冬氨酸的基本培养基中生长较大的菌落，分离纯化，保藏。 2.3.8.3 谷氨酰胺抗性突变株的平板筛选适当的诱变菌液0.2 m L涂布到含不同量的Gln的基本培养基中，选择菌体不能生长时的谷氨酰胺添加量，加入到基本培养基中，制成筛选平板，将诱变菌液涂布筛选平板后32 ℃培养2 d，选取生长的菌落，分离纯化，保藏。

1.2.1初筛取目的菌液的种子液（对数期），稀释至10-7，涂布完全培养基，32 ℃培养3d，然后牙签法点种于两个相同的完全培养基平板，用打孔器在平行平板的其中一个的相同的菌落上方打孔，取出琼脂柱，置于96孔板之中，滴加0.1 %甲基红溶液1滴，颜色由红至黄，表明菌株产酸由高到低。选取产酸相对较高的菌株，用另一平行平板保藏，以备复筛。

1.2.2复筛将初筛得到的菌株以24孔板进行种子培养以及发酵培养后，滴加中性红检测产酸水平(平行三个实验)，选取相对较红的菌液对应的菌株保藏，以备复筛II。

1.2.3复筛Ⅱ将复筛I得到的菌株摇瓶发酵，筛选高产菌株（平行三组实验）。

1.2.4 分析方法 2.3.9.1 p H 的测定取少量发酵液于精密p H试纸确定p H。

1.2.5菌体生长曲线测定取活化菌种两环接入装有30 m L/250 m L三角瓶中（加15粒玻璃珠，下同。），摇床培养16 h后，以2 %接种量转接到另一相同的完全液体培养基中继续培养，每隔2 h取样一次，用蒸馏水稀释100倍后，用752分光光度计于波长620 nm条件下测量吸光度(A620)。以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制菌体生长曲线，平行三次试验。 2.3.9.3 谷氨酸含量及残糖含量的测定用SBA-40C多功能谷氨酸-葡萄糖分析仪测定样品的谷氨酸以及残糖。样品经稀释后由定量进样针吸取25 μL，并快速注入反应池，读取相应的数值，记录。

二、摇瓶分批发酵产谷氨酸的发酵条件优化

2.1材料与方法

2.1.1实验菌株诱变得谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）W3-4-12（Glnr，Asp 渗漏性）。

2.1.2实验仪器与试剂

2.1.3实验用培养基（g/L）

优化得种子培养基葡萄糖 25，玉米浆 26， K2HPO4 1.2，Mg SO4 0.6，尿素 6.0，[p H 7.2]。

优化得发酵培养基葡萄糖 130，尿素 8，KCl 0.7，Na2HPO4 0.9，Mg SO4 0.5，Mn SO4 0.5，Fe SO4 0.3，玉米浆 4，糖蜜 4，[p H 7.2]。

2.1.4分析方法同上

2.1.5实验结果与分析

2.2 种子培养条件的优化

种子液一般培养至对数生长期，因为对数生长期的菌体生长旺盛，可以于克服菌体接入发酵培养基对环境的不适应性。种子培养条件的优化，是发酵优化的基础环节。接下来，实验通过对种子培养基成分配比、种子液 p H、种子培养基装液量、种龄、接种量五个基本要素进行试验，确定最优方案。

2.2.1尿素对种子液的影响

种子液的培养为 10 h，期间不人为干预种子液 p H，所以作为缓释作用的尿素对种子液的培养十分关键。试验对种子液添加不同量的尿素，然后通过发酵产酸测定最佳尿素添加量。平行三次实验，记录平均值。并测定菌浓 OD620。结果如图3.2，当尿素添加量为 0.6 %时，谷氨酸产量较高，为 81 g/L。

2.2.2装液量对种子液的影响

试验以 250 m L 锥形瓶进行种子培养，发酵产酸，平行三组试验。由图 3.3 可知，种子液的菌浓随摇瓶装液量的降低而下降，20 m L 与 40 m L 的菌浓曲线变化幅度最大。因为谷氨酸发酵为耗氧发酵，种子液的装液量对菌体生长影响明显。当装液量为 20 m L 时虽然菌体获得更多的氧浓度，但是当需氧浓度超过菌体生长最佳量时，菌体浓度的增加量与 25 m L 装液量相比不升反降。并且高溶氧也不利于后期产酸。而当菌液为 40 m L 时，溶解氧浓度明显下降，菌浓也有明显的下降，为各试验值的最低，同时，产酸量也为最低。虽然种子培养液是富集菌种的步骤，但不是菌浓越大越好，综合菌体浓度与后期发酵产酸结果来看，选择在 250 m L 锥形瓶中盛装 25 m L 种子培养基时发酵产酸较好，此时的菌体 OD 值 0.805，谷氨酸产量为 83 g/L。

2.2.3种龄对发酵培养的影响

由前述可知，种龄选择为 8~16 h 为宜，进一步试验（平行三组）结果如图 3.4（a）：可知种龄为 12 h 时有产酸最高点，为 83 g/L，所以最佳种龄为 10~14 h。为进一步确定种龄时间，选择种龄培养梯度 10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5 h 进行同条件下试验，结果如图 3.4（b），可知种子液培养 11 h 时，发酵产酸最多，为 84 g/L。

2.3发酵培养条件的优化

2.3.1不同碳源对谷氨酸发酵的影响

碳源是菌体生长骨架以及能量代谢的来源，不同的碳源对菌体生长均有不同的影响。几乎所有的谷氨酸生产菌株都不能直接利用淀粉，因为大多数菌株内不含有淀粉酶。在相同条件下，分别添加相同浓度的葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、果糖、醋酸作为碳源进行发酵试验，添加量为 14 g/L，结果所示，蔗糖与葡萄糖作为碳源对谷氨酸发酵影响最大，产酸最高。因为蔗糖与葡萄糖成本最高，很多工厂一般都用淀粉糖水解液作为碳源发酵生产谷氨酸。本试验选择葡萄糖作为碳源。

2.3.2不同氮源对谷氨酸发酵的影响

氮源是构成菌体成分的主要物质，不同的氮源对菌体生长状态影响不同，糖蜜与玉米

浆含有菌体生长所必需的众多营养因子，尿素作为氮源，还可以调节菌体生长过程中的 p H 值，所以试验在原培养基基础上，分别添加相同浓度的蛋白胨、酵母膏、酵母浸提物、硫酸铵作为外加氮源与原培养基进行发酵试验，外加氮源添加量为 10 g/L。

2.3.3不同无机盐离子对谷氨酸发酵的影响

无机盐和微量元素是谷氨酸发酵中菌体生命活动不可或缺的物质，谷氨酸生产菌株对其的需求量不高，但无机盐离子过多或过少都会影响发酵产酸。其中磷酸盐含量对产酸影响比较大，钾盐次之，Mn2+、Fe2+、Mg2+影响较小。试验对几种盐离子进行比较，选择磷酸盐与钾盐试验，试验共分为三组，如下： A：0.06 %KCl+0.09 %Na2HPO4[55]； B：0.1 %KH2PO4； C：A+B。

2.3.4发酵培养基的单因素优化试验

（1）葡萄糖浓度对谷氨酸发酵的影响初始葡萄糖浓度的不同，影响发酵产酸水平。不同葡萄糖浓度下的谷氨酸产量在葡萄糖浓度为 11 %~13 %之间有谷氨酸产量的最高值。

（2）尿素浓度对谷氨酸发酵的影响尿素可以作为谷氨酸发酵的氮源，同时可以控制发酵初期的 p H 值。发酵初期，菌体生长范围较广，在 p H 6.5～p H 8.0 条件下均能正常生长。当 p H 值控制在7.5 左右时，菌体生长最为旺盛。尿素添加量的测定以及发酵 8h 后的发酵液 p H 值的测定结果如图 3.9，p H 值随尿素的添加量的增加呈明显提高趋势。p H 值过低，菌体易衰老，不利于菌体繁殖，产酸量最低；p H 过高时，菌体易自溶，同样影响产酸水平。发酵培养基中尿素添加量为 0.7 %～0.9 %时，发酵产酸有最大值 91 g/L，此区间的 p H 值为 6.5～8.0。

（3）KCl的含量对谷氨酸发酵的影响KCl对谷氨酸发酵的影响如图3.10，伴随钾离子浓度的增高，菌体的OD净增值与谷氨酸产量都上升，在最高峰值后下降。钾离子浓度为0.08 %左右时，谷氨酸产量最高。K+虽然不参与细胞物质的组成，但它是许多酶的激活剂，能够促进糖代谢。适当的钾离子浓度可以保证菌体的繁殖浓度，也使得酶促反应的酶活较高，得到高水平的谷氨酸产量。

（4）Na2HPO4的浓度对谷氨酸发酵的影响以不同浓度的 Na2HPO4加入培养基发酵，结果如图 3.10，随 PO43+浓度的增高，净增 OD 值与谷氨酸含量都在逐步提高后达最大值，随后，当 PO43+继续增大时，谷氨酸含量下降。由图 3.10 与图 3.11 可以看出无机盐离子对谷氨酸产量的影响相对较小，主要是因为生产原料糖蜜与玉米浆中已经含有一定的无机盐离子，所以培养基中添加的无机盐离子含量较少，添加幅度的增加或减少对发酵产酸有影响，但不是最主要的影响因素。

（5）金属离子的含量对谷氨酸发酵的影响金属离子 Mg2+和 Fe2+对谷氨酸发酵的影响更小一些，我们以他们的组合为单位，探讨这两种离子添加比例对发酵产酸的影响。试验添加的金属离子量分别为： A：Mg SO4 0 %，Fe SO4 0.03 %。 B：Mg SO4 0.05 %，Fe SO4 0.03 %。 C：Mg SO4 0.05 %，Fe SO4 0.03 %。发酵结果如图 3.12 所示，金属离子对谷氨酸的影响是比较小的，从发酵结果中可以看出，当 Mg SO4的浓度为 0 %时，发酵产酸相对较低，比 Fe SO4浓度为 0 %时产量低，所以，Mg SO4的浓度对发酵结果的影响较 Fe SO4的浓度对发酵结果的影响大一些。最终 C 组的安排较为合理。

2.3.5正交试验确定关键因素添加量

由以上试验可知，在谷氨酸发酵过程中，碳源中的葡萄糖含量、氮源中的尿素含量、无机盐KCl和 Na2HPO4对谷氨酸发酵的影响较大，通过单因素优化，得到了四种元素的最佳区间分别为：14 %~16 %、0.7 %~0.9 %、0.07 %~0.09 %、0.09 %~0.11 %。在四个水平上进行 L9 (34)正交试验，发酵结束以谷氨酸产量（g/L）为试验指标进行试验。

2.3.5.1玉米浆糖蜜配比对谷氨酸发酵的影响玉米浆与糖蜜是谷氨酸发酵中的重要原料，但是由于其来源不是很固定，所以玉米浆与糖蜜的差别也很大。味精生产工业中，常用糖

浆含有菌体生长所必需的众多营养因子，尿素作为氮源，还可以调节菌体生长过程中的 p H 值，所以试验在原培养基基础上，分别添加相同浓度的蛋白胨、酵母膏、酵母浸提物、硫酸铵作为外加氮源与原培养基进行发酵试验，外加氮源添加量为 10 g/L。

2.3.3不同无机盐离子对谷氨酸发酵的影响

无机盐和微量元素是谷氨酸发酵中菌体生命活动不可或缺的物质，谷氨酸生产菌株对其的需求量不高，但无机盐离子过多或过少都会影响发酵产酸。其中磷酸盐含量对产酸影响比较大，钾盐次之，Mn2+、Fe2+、Mg2+影响较小。试验对几种盐离子进行比较，选择磷酸盐与钾盐试验，试验共分为三组，如下： A：0.06 %KCl+0.09 %Na2HPO4[55]； B：0.1 %KH2PO4； C：A+B。

2.3.4发酵培养基的单因素优化试验

（1）葡萄糖浓度对谷氨酸发酵的影响初始葡萄糖浓度的不同，影响发酵产酸水平。不同葡萄糖浓度下的谷氨酸产量在葡萄糖浓度为 11 %~13 %之间有谷氨酸产量的最高值。

（2）尿素浓度对谷氨酸发酵的影响尿素可以作为谷氨酸发酵的氮源，同时可以控制发酵初期的 p H 值。发酵初期，菌体生长范围较广，在 p H 6.5～p H 8.0 条件下均能正常生长。当 p H 值控制在7.5 左右时，菌体生长最为旺盛。尿素添加量的测定以及发酵 8h 后的发酵液 p H 值的测定结果如图 3.9，p H 值随尿素的添加量的增加呈明显提高趋势。p H 值过低，菌体易衰老，不利于菌体繁殖，产酸量最低；p H 过高时，菌体易自溶，同样影响产酸水平。发酵培养基中尿素添加量为 0.7 %～0.9 %时，发酵产酸有最大值 91 g/L，此区间的 p H 值为 6.5～8.0。

（3）KCl的含量对谷氨酸发酵的影响KCl对谷氨酸发酵的影响如图3.10，伴随钾离子浓度的增高，菌体的OD净增值与谷氨酸产量都上升，在最高峰值后下降。钾离子浓度为0.08 %左右时，谷氨酸产量最高。K+虽然不参与细胞物质的组成，但它是许多酶的激活剂，能够促进糖代谢。适当的钾离子浓度可以保证菌体的繁殖浓度，也使得酶促反应的酶活较高，得到高水平的谷氨酸产量。

（4）Na2HPO4的浓度对谷氨酸发酵的影响以不同浓度的 Na2HPO4加入培养基发酵，结果如图 3.10，随 PO43+浓度的增高，净增 OD 值与谷氨酸含量都在逐步提高后达最大值，随后，当 PO43+继续增大时，谷氨酸含量下降。由图 3.10 与图 3.11 可以看出无机盐离子对谷氨酸产量的影响相对较小，主要是因为生产原料糖蜜与玉米浆中已经含有一定的无机盐离子，所以培养基中添加的无机盐离子含量较少，添加幅度的增加或减少对发酵产酸有影响，但不是最主要的影响因素。

（5）金属离子的含量对谷氨酸发酵的影响金属离子 Mg2+和 Fe2+对谷氨酸发酵的影响更小一些，我们以他们的组合为单位，探讨这两种离子添加比例对发酵产酸的影响。试验添加的金属离子量分别为： A：Mg SO4 0 %，Fe SO4 0.03 %。 B：Mg SO4 0.05 %，Fe SO4 0.03 %。 C：Mg SO4 0.05 %，Fe SO4 0.03 %。发酵结果如图 3.12 所示，金属离子对谷氨酸的影响是比较小的，从发酵结果中可以看出，当 Mg SO4的浓度为 0 %时，发酵产酸相对较低，比 Fe SO4浓度为 0 %时产量低，所以，Mg SO4的浓度对发酵结果的影响较 Fe SO4的浓度对发酵结果的影响大一些。最终 C 组的安排较为合理。

2.3.5正交试验确定关键因素添加量

由以上试验可知，在谷氨酸发酵过程中，碳源中的葡萄糖含量、氮源中的尿素含量、无机盐KCl和 Na2HPO4对谷氨酸发酵的影响较大，通过单因素优化，得到了四种元素的最佳区间分别为：14 %~16 %、0.7 %~0.9 %、0.07 %~0.09 %、0.09 %~0.11 %。在四个水平上进行 L9 (34)正交试验，发酵结束以谷氨酸产量（g/L）为试验指标进行试验。

2.3.5.1玉米浆糖蜜配比对谷氨酸发酵的影响玉米浆与糖蜜是谷氨酸发酵中的重要原料，但是由于其来源不是很固定，所以玉米浆与糖蜜的差别也很大。味精生产工业中，常用糖

蜜来调节菌量，因为糖蜜含有丰富的维生素 B1、B2，叶酸，生物素等生长因子；一般认为玉米浆与产酸的关系较为密切，因为玉米浆中的钾、镁等离子较为丰富。试验为了确定玉米浆与糖蜜的配比，设计了 A~G 组的配比方案，如表 3.4 中所示，配制发酵培养基。发酵产酸结果如图 3.14 所示，当玉米浆糖蜜比为 1：1，都为 0.4 %时谷氨酸产量最大。同时可知，糖蜜过高，不利于产酸。C、F 组添加糖蜜过高，菌体会保持较长时间的连续生长，导致发酵产酸较少或者只长菌不产酸，对谷氨酸发酵生产不利。

2.3.5.2谷氨酸发酵培养条件的优化

（1）接种量对发酵培养的影响接种量对发酵产酸的影响在于：接种量过小，延滞期长，菌体生长缓慢，菌浓较低，发酵周期延长，产酸水平低；接种量过大往往菌体生长过快，同时培养基黏度大，影响溶氧，衰老细胞增加，最终影响产物合成。所以接种量的选择对发酵结果至关重要。由种子液的接种量分别为 10、15、20 %的发酵培养结果如图 3.15（a）可知接种量为 5 %~10 %时有谷氨酸产量峰值，当接种量大于 10 %时，谷氨酸产量是降低的，当接种量增大至 15%时谷氨酸产量下降速度较快，只有 61 g/L。进一步试验选取种子液的接种量分别为 5、6、7、8、9、10 %进行发酵测试，发酵培养结果如图 3.14（b），当接种量为 7 %时，发酵产酸最高，为 98 g/L。

（2）装液量对谷氨酸发酵的影响对 250 m L 锥形瓶的装液量进行探讨，以 10、20、30、40、50/250 m L 装液发酵的产酸量分别为：103、100、99、95、75 g/L，从而得知溶解氧严重制约着谷氨酸产量，低溶解氧时：发酵积累大量的乳酸，使发酵液的 p H 值下降，不利于谷氨酸的生产，同时，葡萄糖转化成了乳酸，降低了产物的提出率[57]。紧接着监测了250 m L 锥形瓶发酵时的极限装液量，记录结果如图 3.16（a），可知 250 m L 锥形瓶的装液量极限是 8 m L，增加玻璃珠的个数有助于提高产酸量，可换用 500 m L锥形瓶并改用三层纱布包扎继续试验。250 m L 锥形瓶与 500 m L 锥形瓶发酵结果如图 3.16（b），500 m L 锥形瓶装液极限量为 10 m L，15 m L 与 20 m L 装液量时，谷氨酸产量最高为 107 g/L。从对比图中可以看出，500 m L 锥形瓶发酵产酸比 250m L 锥形瓶的产量要高，而且对产量的影响很大，所以后续试验选用 500 m L 锥形瓶盛装 15 m L 发酵液进行发酵。

（3）尿素添加量对谷氨酸发酵的影响对相同条件下发酵的三瓶发酵液产酸量平行试验观察，选择产量最高的一瓶发酵液的尿素添加量与 p H 的变化进行分析，寻找尿素添加量的控制阶段。由图3.17 可知，当 p H 均为 7.7 或 7.8 时，尿素的添加量明显不同。18 h 后，要根据菌体生长适当提高尿素添加量，20～26 h 内是 p H 下降最快的时段（这一特征仅对于该菌种而言），28 h 开始，又要适当的降低尿素的添加量。所以整个 p H 控制阶段，要分三段（10～18 h、18～26 h、26～34 h）控制，添加量要根据对试验的熟悉程度适量添加。

（4）p H 控制对谷氨酸发酵的影响如绪论的讨论，p H 值的控制影响谷氨酸脱氢酶的活力，当 p H 值维持在 7.2左右时，谷氨酸发酵有最高产酸水平。试验分别以出发菌种进行发酵，对 p H 控制做如下处理（前 8h 发酵不控制 p H 值）： A：8~12 h 控制 p H 7.5 左右，12~28 h 控制 p H 7.2 左右，28~36 h 控制 p H 7.0左右。 B：8~36 h 控制 p H 7.2 左右。 C：8~12 h 控制 p H 7.0 左右，12~28 h 控制 p H 7.2 左右，28~36 h 控制 p H 7.5左右。 D：8~12 h 控制 p H 7.5 左右，12~28 h 控制 p H 7.2 左右，28~36 h 控制 p H 7.5左右。 E：8~12 h 控制 p H 7.0 左右，12~28 h 控制 p H 7.2 左右，28~36 h 控制 p H 7.0左右。每种控制状态平行 3 组试验，记录平均值，结果如图 3.18（a）所示，A 组试验谷氨酸产量最高，E、B 组次之，且这三组都是后期 p H 控制在 7.0 左右，以 6.8为宜。其 p H 分布图如图 3.18（b）所示。通过试验数据可知，前期 p H 控制在 7.5左右，谷氨酸产量最高。产物形成期，p H 宜控制在 7.2 左右。

（5）温度对谷氨酸发酵的影响培养温度影响谷氨酸脱氢酶的活性，试验设计为：在原发酵工艺阶段中温度的基础上正负改变两度进行试验，处理如下： A：0～12 h，30、31、32、33、34 ℃，200 r/min；12～24 h，35 ℃，220 r/min；24～36 h，36 ℃，240 r/min。 B：0～12 h，33 ℃，200 r/min；12～24 h，33、34、35、36、37 ℃，220 r/min；24～36 h，36 ℃，240 r/min。 C：0～12 h，33 ℃，200 r/min；12～24 h，35 ℃,220 r/min；24～36 h，34、35、36、37、38 ℃，240 r/min。试验结果如图 3.19 所示，C 组温度对产酸量影响较大，也就是发酵过程后期要提高发酵温度，利于谷氨酸的积累。最终确定发酵温度为：0～12 h，33 ℃，200 r/min；12～24 h，35 ℃，220 r/min；24～36 h，38 ℃，240 r/min。

（6）分瓶发酵提高溶氧水平对谷氨酸发酵的影响由装液量的探讨可知，溶解氧水平是制约谷氨酸发酵的主要因素之一。无论是 250 m L 锥形瓶还是 500 m L 锥形瓶进行谷氨酸发酵，谷氨酸产量都是随发酵液的盛装量的减少而上升，而且趋势十分明显。但是随着培养基的减少，营养成分也相对减少，接入的菌体生长到一定程度会影响其繁殖，当营养程度降低到一定水平，有些菌体呈现不增长状态，甚至会因菌体衰老、自溶而使发酵提前结束。所以虽然采用 500 m L 锥形瓶盛装 15m L 液体的方案可以提高谷氨酸的产量，但是效果也较为有限。试验根据菌体繁殖期与产物生成期的不同设计了“分瓶发酵”的试验方法。因为谷氨酸发酵是典型的菌体繁殖与产物生成部分相关的模型，这种模型产物的生成与菌体生长部分相关，表现为长菌期谷氨酸产量极低，甚至为零，而生产期主要以积累谷氨酸为主。试验通过测定谷氨酸产量的变化，确定菌体由“生长型”向“生产型”转变的时间点，进行分瓶发酵。以 30 m L/500 m L 锥形瓶进行发酵试验，并以 15 m L/500 m L 作为对照试验，取样测定谷氨酸产量做产量图与生长曲线图，根据图 3.20 显示的结果，选取发酵培养 15 h 的菌体即为“生长型”向“生产型”转变的时间点，分装发酵液至 15 m L/500 m L 锥形瓶进行摇床发酵，并作对照试验。结果如图 3.20 所示，以 30 m L/500 m L进行谷氨酸发酵，10 h 后开始产酸，实验选择发酵 15 h 后分装至 15 m L/500 m L 锥形瓶中继续发酵，并继续记录谷氨酸产量。可以看出 16 h 后，谷氨酸产量增加缓慢，产酸率甚至有所降低，但进入 20 h 后，谷氨酸产量又进一步加大，22~28 h 时产酸率不断提高，虽然 28 h 后产酸率有所下降，但是谷氨酸产量仍然稳定增加，直至 38 h 时产量达到最大 113 g/L，38 h 后谷氨酸产量有所下降，原因有可能是部分谷氨酸被分解。产幅最大的是 24～30 h。

三、实验结果与分析

以谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）W3 为出发菌株，对其生产能力及基本性状进行鉴定，确定其为经历生产考研的稳定性良好的谷氨酸生产菌，平均产量为 65 g/L。菌株的紫外诱变时间为 90 S，亚硝酸钠诱变条件为：0.2 mol/L作用 30min。经过紫外与亚硝酸钠复合诱变，得到高产的谷氨酸营养缺陷型回复突变株 W3-2-77，以 W3-2-77 为出发菌株经紫外诱变筛选了天冬氨酸渗漏性营养缺陷型菌株 W3-3-18，此菌株再经紫外诱变得到目的菌株 W3-4-12（天冬氨酸渗漏性、谷氨酰胺抗性），经过多次传代测试，该菌株具有良好的遗传标记以及稳定的产量，约为 78 g/L，比出发菌株的谷氨酸产量提高 21 %。

对该菌株的种子培养基的研究表明：种子培养基中尿素的最佳添加量为0.6 %，种龄 11 h，一级接种量 7 %，最佳装液量 25 m L/250 m L 锥形瓶。通过单因素实验确定了发酵培养基中各因素的添加量区间，进而通过 L9(34)正交试验确定具有显著影响的四因素的最佳含量，最终的发酵培养基为：葡萄糖 130，尿素 8，KCl 0.7，Na2HPO4 0.9，Mg SO4 0.5，Mn SO4 0.5，Fe SO4 0.3，玉米浆 4，糖蜜 4，[p H 7.2]。通过对发酵条件的研究，确定

发酵最佳条件：装液量 30 m L/500 m L 锥形瓶，发酵 15 h 后分瓶发酵，装液量 15 m L/500 m L 锥形瓶，0～12 h，33 ℃，200 r/min；12～24 h，35 ℃，220 r/min；24～38 h，38 ℃，240 r/min。8~12 h：p H 7.5左右，12~28 h：p H 7.2 左右，28~36 h：p H 7.5 左右，发酵周期 38 h。通过优化，有效的提高了谷氨酸发酵过程的溶氧水平，谷氨酸产量较为稳定，谷氨酸产量为112 g/L，糖酸转化率 62 %，比未优化条件下产量提高了 44 %。