PH0710 膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒操作手册
PH0710|膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒
MembraneandCytosolProteinExtractionKit
CatalogNo：PH0710Size:□50T□100T
◆产品简介
膜蛋白与浆蛋白抽提试剂盒(MembraneandCytosolProteinExtractionKit)提供了一种比较简单、方便地从培养细胞或组织中抽提细胞膜蛋白和细胞浆蛋白的方法。抽提的膜蛋白不仅包括质膜上的膜蛋白，也包括线粒体膜、内质网膜和高尔基体膜等上的膜蛋白,通过匀浆适度破碎细胞，经低速离心去除细胞核和少数未破碎的细胞产生的沉淀，随后取上清高速离心获得细胞膜沉淀和含有细胞浆蛋白的上清，然后通过优化的膜蛋白抽提试剂从沉淀中抽提获取膜蛋白。
约90分钟即可完成培养细胞或组织的细胞膜蛋白与细胞浆蛋白的分离和抽提。抽提得到的蛋白可以用于SDS-PAGE，Western、酶活性测定等后续实验。不适合用于蛋白酶、磷酸酯酶等受这些抑制剂影响的酶的活性测定。
本试剂盒采用独特的组分，提取细胞及组织中的膜蛋白。特殊的溶液系统，在裂解细胞的同时，还可以选择性低地分离提取细胞膜蛋白与细胞器膜蛋白。提取方法简单，可靠，快速，获得的膜蛋白纯度高，可用于SDS-PAGE电泳、WesternBlot、免疫沉淀等后续实验，每次可以提取107个培养细胞或200mg动物组织。
◆产品组分
◆保存条件
常温运输，收到后，DTT在-20℃保存，其余组分4℃保存，一年有效。
使用说明
1．准备细胞或组织样品：
A．细胞
贴壁细胞：培养约2000-5000万细胞，用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞或用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。
悬浮细胞：培养约2000-5000万细胞，直接离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。
B.对于组织：
取约100毫克组织，用剪刀尽量小心剪切成细小的组织碎片
2．样品洗涤：用适量的已稀释的洗涤液洗涤样品三次，每次3000rpm离心2min。
3．样品裂解：在上述细胞或组织中加入1ml动上下手动匀浆30-50次。或者用超声波破碎细胞，每次30s，3-4次，每次间隔1分钟，置于冰上冷却。细胞破碎后应经镜检，细胞破碎率不小于70%，无明显的组织块。
镜检：通常可以在匀浆30次后取约2-3微升细胞或组织匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察，如见细胞核周晕环(Ashinyringaroundthenuclei)或完整的细胞形态，说明细胞仍完整。如果有70-80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态，说明细胞已经充分破碎，则进行下一步实验。否则，重新匀浆10-30次直到细胞至少70%已经破碎。同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。另外需注意特定的匀浆次数和匀浆器也有关，需同时注意记录使用的是哪一个匀浆器。
注：如果没有适当的玻璃匀浆器，对于培养的细胞也可以采用冻融法来破碎细胞。把步骤2中的样品在液氮和室温依次反复冻融两次，然后取少量样品在显微镜下检测细胞破碎的程度。如果细胞破碎的程度不足70%，可增加冻融次数，直到细胞破碎的程度大于70%。
4.转移裂解液到预冷的1.5ml离心管中，冰上放置10分钟，期间剧烈涡旋2-3次，于4℃，16000rpm离心10min，弃沉淀，上清移至新的离心管中。
5.含上清的离心管37℃水浴10min，室温，13000rpm离心5分钟，样品分成上层与下层（含膜蛋白）。建议使用进口的透明度高的离心管，方便观察分层，在分层交界处有一折光线，需仔细观察才可以见到。
6.取下层，加入500ul冰冷灭菌水混匀，4℃放置5min后，置于37℃水浴10min。
7.室温，13000rpm离心5分钟，样品分成上层与下层（含膜蛋白）。
8.重复第6,7步操作一次，最终取下层即为膜蛋白提取物。BCA法测定蛋白浓度。
9.每100ul莫蛋白提取物加入900ul预冷的丙酮，混匀冰浴20min，16000rpm离心15min。
10.弃上清，沉淀真空干燥或敞盖冰浴10min，用含巯基乙醇或DTT适量的loadingbuffer溶解沉淀。如沉淀难以溶解，可以加入尿素货硫脲等强溶解力试剂。
注意事项
（1）需自备PMSF。PMSF要在抽提前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。
（2）浓缩洗涤液需要去离子水洗涤后再使用。
（3）使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度或Lowry法测定蛋白浓度。
（4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。