复合氨基酸螯合物鉴定方法的研究
分析检测
复合氨基酸螯合物鉴定方法的研究
吴茹怡,曾里,曾凡骏
(四川大学食品工程系,成都610065)
摘要:从氨基酸螯合物的国内外研究现状和进展出发,针对复合氨基酸螯合物样品中成分复杂的实际情况,重点研究出一套定性和定量的鉴定方法,并且讨论了该方法的优缺点。该方法取得了一定的成效:(1)选用无水乙醇对氨基酸螯合物样品进行分离纯化;(2)Na2S化学法和EDTA滴定法可以有效地鉴定复合氨基酸螯合物。
关键词:氨基酸螯合物;纯化;鉴定;螯合率中图分类号:TS201.2
文献标识码:A
文章编号:1005-9989(2006)03-0104-04
Studyonidentificationofcompoundaminoacidchelates
WURu-yi,ZENGLi,ZENGFan-jun
(DepartmentofFoodEngineering,SichuanUniversity,Chengdu610065)
Abstract:Accordingtotheinternalandouternalresearchofpresentsituationandprogressesaboutaminoacidchelates,
andinthelightoftheactualsituationofcomplicateingredientsincompoundaminoacidchelates
samples,thethesislaidemphasisoncarryingoutasetofmethodsofidentifyingthenatureandchelatedper-cent,anddiscussedtheadvantagesanddisadvantagesofthemethods.Certainaccomplishmentshavebeenachieved:(1)choosingethanolwithoutH2Ocanseparateandpurifyaminoacidchelatessamples;(2)Na2SchemicalmethodandEDTAtitrationmethodcanidentifycompoundaminoacidchelatessampleseffectively.Keywords:aminoacidchelates;purify;identify;chelatedpercent
氨基酸螯合物是1个或多个氨基酸基团与金属离子发生配合反应形成的具有环状结构的化合物。一般的氨基酸螯合物结构见图1[1]。
RH
CCO
X1
MO
X2
CR
H
O
C
O
它具有稳定性好、吸收率高、生物效价高、毒性小等优点,目前已经广泛地运用于生产、生活的各个方面,特别是作为一种新型的营养补充剂在药品和保健食品上应用,取得了很好的效果[2-3]。但是,由于氨基酸螯合矿物质原料一般是复合氨基酸螯合物,即多种氨基酸甚至有机酸和金属离子的螯合物。其中组分复杂,化学基团众多,互相干扰仪器的分析,使我们无法对复合氨基酸螯合物进行鉴定。另外,又难于将不同氨基酸的螯合物分开,因此迫切需要一种复合氨基酸螯合物的鉴定方法,来对商品的种类
X-NH2;M-金属离子;R-来自氨基酸或氨基酸和有机酸的混合物的碳
图1一般的氨基酸螯合物结构图
收稿日期:2005-09-09
作者简介:吴茹怡(1982-),女(汉族),四川成都人,硕士研究生,研究方向为保健功能食品的研究与开发。
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和质量作出评价。
目前对于复合氨基酸螯合物的检测大多是分别测定其中氨基酸和金属离子的含量,然而这样不能清楚地反映氨基酸和金属离子的配位情况和螯合的程度,对于其纯度和质量判定的意义不大[1]。
我们在认识氨基酸螯合物的性质的基础上,研究出了一套复合氨基酸螯合物的鉴定方法。本文中我们首先选用无水乙醇对氨基酸螯合物样品进行分离纯化,再用Na2S化学法定性地鉴定了复合氨基酸螯合物样品,最后采用EDTA滴定法测定了该样品的螯合率。研究表明,此套鉴定方法简便易行、重复性好。
1实验材料与设备
氨基酸螯合物样品(包括氨基酸螯合铜、氨基酸螯合铁、氨基酸螯合钙、氨基酸螯合锌样品):CMC
(美国国际螯合公司);
甲醇、无水乙醇、硫化钠:分析纯;重蒸水;二硫腙试剂、茚三酮试剂:用前配制,棕色玻璃滴瓶避光保存;PAN乙醇溶液:5g/L;0.1%二甲酸橙水溶液;EDTA标准溶液:C=0.02mol/L;
烧杯,试管,电炉,漏斗,100mL量筒,250mL锥形瓶,50mL酸式滴定管,干燥皿,50mL容量瓶,
100mL容量瓶,500mL容量瓶,棕色瓶;
马头牌JYT-5型普通天平:架盘药物天平,最大秤量500g,分度值0.5g;TG328A型分析天平:最大载荷200g,分度值0.1mg;恒温水浴锅:HH-S2s型,电源220V、600W,控温范围(5~99℃),精度±1℃;PHS-
3C型精密pH计:上海雷磁仪器厂;电热恒温鼓风干燥箱:DHG-9053A型,上海精密实验仪器设备有限公司。
2实验原理2.1分离纯化
氨基酸螯合物原料中含有的未配位的游离氨基酸和金属离子作为干扰物质会影响对氨基酸螯合物中螯合部分的鉴定。所以要对氨基酸螯合物样品进行分离纯化。
由于氨基酸螯合物在乙醇等有机溶剂中的溶解度极小,而微量的游离金属离子和氨基酸都能溶于有机溶剂。所以利用二者在有机溶剂中溶解度的差异,可以采用有机溶剂处理的办法来纯化氨基酸螯合物。
另外,因为二硫腙的N原子很容易提供一弧电子与金属离子配位,生成易溶于三氯甲烷或四氯化碳
分析检测
的红色络合物[4](510nm处有最大吸收峰)。又因为茚三酮在弱酸(pH=5)的条件下,对氨基酸起氧化、脱氨化作用使之分解为氨、二氧化碳和醛,茚三酮本身被还原,再与生成的氨缩合成紫色物质,所以在分离纯化前后可以分别用二硫腙试剂和茚三酮试剂来定性地检测游离金属离子和游离氨基酸[5]。
2.2定性鉴定
氨基酸螯合物是氨基酸基团中的C和N原子与金属离子配位,形成环状的螯合分子结构。一般可溶性无机盐是离子晶体,它们可溶于水,正是由于正负离子受到极性分子的作用而形成水合离子的缘故。而配合物的中心离子和配位体之间的结合,是由中心离子提供与配位数相同数目的空轨道来接受配位体提供的孤对电子,形成稳定的配位键。螯合键是配位键的一种。所以纯的氨基酸螯合物在水中没有游离的氨基酸和金属离子。
由于金属硫化物的稳定常数远大于氨基酸螯合物的稳定常数,当加入硫化钠时,S2-与稳定螯合物中的金属离子反应,生成了更稳定的的金属硫化物沉淀,从而使氨基酸螯合物中的氨基酸游离出来[6]。可以利用氨基酸螯合物这一特有的性质来对样品进行定性鉴定。
2.3测定螯合率
氨基酸金属元素螯合物通过配位键形成了一个内络盐结构,稳定性较好,稳定常数在104~105,但
EDTA-M络合物的稳定常数lgK=18.8,远大于氨基酸金属螯合物的稳定常数,因此可以用EDTA配位滴定法直接滴定氨基酸螯合物中的金属元素[6]。由此可以计算出样品的螯合率和金属元素的总含量:
螯合率(%)=螯合态金属元素的含量×100
=CV1×100=V1×10000
式中:C———标准EDTA溶液的浓度,mol/L;
V1———
滴定螯合态金属元素所消耗的EDTA溶液的体积,mL;
V0———
滴定金属元素总量所消耗的EDTA溶液的体积,mL。
金属元素的总量(%)=C×V×10-3×M×4×100
式中:C———标准EDTA溶液的浓度,mol/L;
V0———
滴定金属元素总量所消耗的EDTA溶液的体积,mL;
M———
金属元素的分子量,g/mol;m———
称取的样品量,g。No.3.
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EDTA-M络合物的指示剂根据不同的金属元素各有不同。氨基酸螯合铜、氨基酸螯合铁可以用PAN指示剂,氨基酸螯合锌、氨基酸螯合铁、氨基酸螯合钙可以用二甲酸橙指示剂。
3实验方法3.1样品的分离纯化
称一定量的氨基酸螯合物样品,加50mL无水乙醇,用玻璃棒搅拌,静置,弃去上清液,如此循环,若是有色溶液则直到溶液无色为止,若是无色溶液,则循环洗涤3次。取上清液,滴入二硫腙试剂,若显红色则重复以上步骤,若不显红色则进入下一步;过滤溶液,将滤渣烘干。取滤纸上的氨基酸螯合物样品微量,溶于水中,再加入茚三酮试剂5~8滴,在电炉上加热至沸腾,若颜色变成蓝紫色,则再用无水乙醇洗涤,弃去上清液;若颜色不变,则进入下一步。把滤纸上的氨基酸螯合物样品在65℃烘干,得到纯度较高的氨基酸螯合物样品;将纯化后的氨基酸螯合物样品分别用干燥皿装好。
3.2定性鉴定
取一定量纯化后的氨基酸螯合物样品,加入
50mL蒸馏水溶解,再加入茚三酮试剂5~8滴,在电炉上加热沸腾2~3min,观察溶液的颜色变化。另取一定量纯化后的氨基酸螯合物样品,加入25mL蒸馏水溶解,再加入过量的硫化钠,用玻璃棒搅匀,静置一段时间;氨基酸螯合铁和氨基酸螯合铜的溶液即产生黑色的硫化铁和硫化铜沉淀;氨基酸螯合钙和氨基酸螯合锌溶液即产生白色的硫化钙和硫化锌沉淀。过滤,分别得到黄色滤液;分别在滤液再加入茚三酮试剂5~8滴,在电炉上加热沸腾2~3min,观察溶液的颜色变化。
3.3测定螯合率
称取一定量的氨基酸螯合物样品,溶于蒸馏水中,并定容到100mL,摇匀。取25mL到250mL锥形瓶中,加3滴PAN指示剂或二甲酸橙指示剂;用0.02mol/
LEDTA溶液滴定,记下所消耗溶液的体积V0。另称相同量的氨基酸螯合物样品,加50mL乙醇,水浴温热并充分搅拌,离心分离,沉淀用蒸馏水洗,定容到
100mL,摇匀。取25mL到250mL锥形瓶中,加3滴PAN指示剂或二甲酸橙指示剂;用0.02mol/L的EDTA溶液滴定,记下所消耗的溶液的体积V1。计算螯合率和金属元素总量。
4结果与分析
4.1分离纯化前后样品溶液的检验
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表1二硫腙试剂检验氨基酸螯合物样品的
甲醇溶液的实验结果
样品溶液原溶液分离纯化前分离纯化后CaAAC无色透明溶液黄色溶液无色透明溶液ZnAAC
无色透明溶液
浅粉红溶液无色透明溶液
CuAAC淡蓝色透明溶液蓝中带黄溶液淡蓝色透明溶液FeAAC
浅黄色透明溶液
黄色中略带红溶液
浅黄色透明溶液
分离纯化前的氨基酸螯合物样品的甲醇溶液在加入二硫腙试剂以后,无色溶液则呈红色或黄色,有色溶液则呈原色与红色或黄色的混合色,所以二硫腙确实能与游离的金属离子形成有色络合物。从分离纯化前后溶液颜色的变化可知样品中含有游离的金属离子。
表2
茚三酮试剂检验氨基酸螯合物样品的
水溶液的实验结果
样品溶液
原溶液分离纯化前分离纯化后CaAAC无色透明溶液蓝紫色溶液无色透明溶液ZnAAC无色透明溶液蓝紫色溶液无色透明溶液CuAAC淡蓝色透明溶液蓝紫色溶液淡蓝色透明溶液
FeAAC
浅黄色透明溶液
紫红色溶液
浅黄色透明溶液
从分离纯化前后溶液颜色的变化可知样品中含有游离的氨基酸。
4.2定性鉴定结果
加入过量的硫化钠前的氨基酸螯合物样品的水溶液,用茚三酮试剂检测,溶液颜色没有发生改变,加入过量的硫化钠后的黄色滤液,用茚三酮试剂检测,溶液变为紫红色。即原待测物质的溶液中没有游离的氨基酸,在生成了金属无机盐沉淀以后,有了游离的氨基酸。这说明待测物质是氨基酸和金属形成的一种特殊物质,它不是氨基酸金属盐,在水中以离子状态存在,也不像无机沉淀那样不溶于水,即其稳定性大于可溶性无机盐,小于无机沉淀。这种物质就是氨基酸螯合物。此方法主要使用了硫化钠试剂,可以简称为Na2S化学鉴定法。
4.3氨基酸螯合物样品的螯合率
表3
EDTA滴定法测定氨基酸螯合物样品螯合率的
实验结果
样品滴定时的颜色变化螯合率(%)金属元素总量(%)CaAAC紫红变成亮黄色94.915.7ZnAAC紫红变成亮黄色9612.94CuAAC紫红变成亮黄色95.814.07FeAAC
紫红变成黄绿色
93.48
10.27
CMC氨基酸螯合物样品中,氨基酸螯合铜、氨基酸螯合锌、氨基酸螯合铁、氨基酸螯合钙的螯合率分别为95.8%、96%、93.48%、94.9%,由此看出,样品
的质量比较好。
5讨论
二硫腙并不是某一金属的专一指示剂,它与铅生成的络合物溶于三氯甲烷,也呈红色,这样会干扰对氨基酸螯合物溶液中游离金属离子的检验。但是研究表明,二硫腙在pH8.5~9.0的条件下,易与铅形成红色的络合物,而在酸性条件下,易与铜、铁、锌离子形成络合物。氨基酸螯合物的溶液呈偏酸性,并且样品的铅含量很低,在mg/kg级,所以基本上铅对氨基酸螯合物溶液中游离金属离子的检验影响不大。
另外,此法对于有色溶液不好判断,生成的红色络合物与溶液原色混在一起,较难分辨。经研究,可以通过将原溶液的浓度降低,来尽量减少溶液原色对实验结果的影响。
由于络合反应很灵敏,所以指示剂的用量在原则上是在能清楚判别颜色的前提下越少越好。本实验中采用的是加入二硫腙试剂2~3滴,在这个用量下已经能清楚地判断络合物的颜色。大于此量,既是对指示剂的的浪费又影响颜色深浅不同的溶液之间的比较;小于此量,难于对溶液颜色的变化做出准确的判断。
茚三酮与氨基酸反应的灵敏性在很大程度上依赖于氢离子的浓度。强酸、强碱均可阻碍反应的进行,最适的酸碱度为pH=5。而4种氨基酸螯合物的溶液的pH值为5,呈弱酸性,所以在此次实验中显色很灵敏,而且生成的蓝紫色化合物的稳定性很好。
其次,虽然氨基酸螯合铜和氨基酸螯合铁的溶液分别呈蓝色和浅棕黄色,但是由于称取的量很少,溶液的颜色很淡,所以在加热沸腾以后被生成的络合物的蓝紫色覆盖。样品溶液本身的颜色对检验结果的影响很小。
茚三酮试剂的用量5~8滴为宜。若用量太小则不能检验出氨基酸;若用量太大,茚三酮本身加热后变为的红色会影响对溶液颜色改变的判断。
用无水乙醇洗涤氨基酸螯合物样品的方法能有效地将氨基酸螯合物样品纯化,溶剂可以进行回收,从而降低成本。但是,由于反复洗涤多次和检验多次,所以此方法还需要简化步骤、改进实验方案、提高效率和进一步降低成本。
Na2S化学鉴定法反应灵敏、操作简便、重复性好,能够快速而且有效地对氨基酸螯合物进行定性鉴定,但是在实验过程中也发现了如下问题:(1)把过量的硫化钠加入氨基酸螯合物的溶液中,生成的金属硫化物在到达一定的等电点时才能够全部沉淀,
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所以溶液的pH值关系着沉淀的生成。沉淀的最佳pH值对于不同的金属氨基酸螯合物的溶液各有不同,需要以后继续研究;(2)硫化铜、硫化铁和硫化钙是难溶物质。硫化锌是微溶物质,即滤液中溶有少量的硫化锌。但是只要能生成沉淀,置换出的氨基酸能用茚三酮试剂判断,即使氨基酸的量很少,也可以对其进行定性地检测;(3)EDTA测定螯合率的方法具有滴定分析法共有的特点:使用的仪器简单、操作简便、分析速度比较快、测定结果的准确度比较高[9]。特别在此方法中,两次滴定所耗体积之比可以使误差消除,因此EDTA的浓度无需标定。
此方法的随机误差主要与以下因素有关:
(1)滴定突跃的大小。在计量点前后一定的误差范围内溶液性质的突然改变,突跃所在的范围称为滴定突跃[7]。首先,它与指示剂的性质有关。有的指示剂变色灵敏,有的则比较迟钝。其次,本研究中使用的EDTA中的无质子体(Y4-)作为较强的路易斯碱,既是质子论的碱(多元碱)又是较强的螯合剂[7]。但是EDTA的酸效应或干扰离子效应较强时,滴定突跃很小。本次实验测定溶液中只有一种金属离子,不存在干扰离子效应。所以,欲实现金属离子的准确滴定,溶液酸度的选择非常重要。譬如用二甲酸橙指示锌离子、铁离子、钙离子的滴定最佳pH是5~6。用PAN指示铜离子的滴定最佳pH值是2~12[7]。而本次实验中,氨基酸螯合物溶液的pH值均在二者的范围内,所以适用于这种方法的检测。
(2)人眼的判断能力。人的视力对指示剂颜色变化的觉察实际上并不是一个“点”,而是一个范围,这个范围因人而异,且随着指示剂的性质、用量和色调的不同而不同。本次实验的滴定过程中,溶液颜色的变化大,所以人眼的判断误差相对较小。
(3)操作误差。在滴定过程中,滴下半滴指示剂的瞬间,溶液颜色变化,并且在半分钟之内不变色,此时则为滴定终点。半滴大约是0.05mL,通常的操作误差为半滴或1滴,即0.05~0.1mL,以滴定所消耗的最少的EDTA的量计算,误差最大的为1%,所以操作误差对氨基酸螯合物的质量评价的影响不大。
6结论
本研究总结出一套鉴定复合氨基酸螯合物的方法:(1)定性鉴定:用茚三酮试剂分别检测加入硫化钠前后的纯化后待测物溶液中的游离氨基酸,若在原溶液中没有游离氨基酸,而在加入硫化钠生成沉淀后有游离氨基酸,则证明该物质是氨基酸螯合物;
(下转第112页)
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!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
(上接第107页)
(2)对复合氨基酸螯合物的定量分析:用EDTA滴定螯合态金属离子和金属离子总量的方法来测定该氨基酸螯合物样品的螯合率。根据螯合率的大小,对其质量做出评价。
由于没有氨基酸螯合物的标准品,所以需要进一步研究一种方法来验证此套鉴定方法的准确性。
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◇本刊启事◇
通知
根据本刊的编排计划和配合食品行业各专业学科的行动安排,《食品科技》准备在2006年10月编辑出版食品配料论文集,内容包含国家关于食品配料与添加剂方面的最新要求、食品配料及添加剂产业发展趋势、食品配料新资源、食品配料加工新工艺、新技术、新装备、营养强化、配料与添加剂的安全使用,国外相关技术的介绍、相关企业的介绍与宣传等。请广大读作者配合我们,积极推荐与上述内容相关的稿件。并欢迎就如何办好此专辑提出宝贵建议。
本刊启
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No.3.
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