微卫星的构成及其检测技术

第21卷第2期2004年4月

　

生物学杂志JOURNA L OF BI O LOGY

　

Vol. 21　No. 2Apr ,2004

文章编号:1008-9632(2004) 02-0001-03

微卫星的构成及其检测技术

管　峰1, 杨利国2, 贾名威1, 程瑞禾1, 茆达干1

(11南京农业大学家畜繁育研究所, 南京　210095;21华中农业大学动物科技学院, 武汉　430070)

摘　要:微卫星标记是近几年来发展起来的一种新型分子标记, 由于其具有检测方便, 多态性高、共显性遗传、符合孟德尔遗传定律、重复性好等优点, 所以在动物遗传育种中作为标记辅助选择的手段日益得到广泛关注。试就微卫星的构成及特点、以及检测技术及应用作一综述, 旨在为该技术的推广应用提供理论依据。关键词:微卫星; 检测技术; 应用中图分类号:Q331

文献标识码:A

1　微卫星的构成及特点

1974年Skinner 等在寄居蟹的基因组中发现了含T AGG 重复单位的简单重复序列, 随后也在人和其他

真核基因组中发现了大量简单重复序列, 单位小(核心序列2—4bp ) , 中的短串联重复序列() , 其具有突变速率快、多态性高等特点。

微卫星又称为短串联序列重复(short tandem repeats ,STRs ) , 简单序列重复(Sim ple sequence repeat , SSR ) , 常见的有二、三、四核苷酸重复序列, 约占真核基因组的5%。其基本构成单位为2—6bp , 多位于编码区附近, 也可位于基因内的间隔区、外显子、内含子和调控区域, 且分布均匀[1]。根据微卫星的重复类型可以把微卫星分为三类:即完全、不完全和复合型微卫星。微卫星在基因组中数目巨大, 据估计, 真核基因组中平均每6kb 就存在一个微卫星序列[2]。人类基因组中约有5×104～1×105个(C A ) 重复, 重复次数一般为15～60次, 重复单位相同, 其长度一般小于200bp , 但也有更长[3]。

每个特定位点的微卫星DNA 均由两部分构成:中间的核心区和外围的侧翼区。核心区含有一个以上的称为“重复”的短序列, 一般该重复单位的碱基对

数目不变, 的, 。不同动物个体; , 或者两者均不同。对侧翼序列研究表明, 微卫星侧翼序列突变少, 一般为单拷贝序列, 因此单拷贝的侧翼序列可以将微卫星特异定位于染色体的某一部位, 这样, 动物中该特定微卫星位点的等位基因差异主要来自不同数目的串联重复[4]。

微卫星是目前发展最快的一类分子标记, 与其他标记技术相比, 具有以下特点:(1) 保守性　微卫星序列在哺乳动物中间具有一定程度的保守性, 即在一些紧密相关的物种中其重复单位和重复次数具有一定相似性; (2) 等显性遗传　微卫星标记的等位基因符合孟德尔遗传定律, 呈等显性遗传; (3) 多态性　在正常动物群体中显多态现象, 即微卫星拷贝数在某一群体中是可变的; (4) 具有遗传连锁不平衡现象; (5) 均可被转录, 有些编码蛋白质, 而另一些则不编码蛋白质(位于非转译区的5′和3′端) ; (6) 微卫星属于不稳定的DNA 序列, 其数目在某些遗传病中有扩增现象, 而这种扩增并非是减数分裂和重组造成的, 扩增发生在减数分裂过程中, 也可以发生在有丝分裂过程中, 并且可以遗传, 而导致嵌合体形成; (7) 在不同基因位点上的微卫

收稿日期:2003-　　　

07-03; 修订日期:2003-12-08

作者简介:管　峰(1977-) , 男, 在读博士研究生, 主要研究方向:动物遗传育种与繁殖,E -mail :dfg20001051@yahoo. com. cn ;

杨利国(1962-) , 男, 教授, 博导, 国际动物繁殖学会常务理事, 中国畜牧兽医学会养羊学分会副理事长, 中国动物繁殖研究会副理事长等, 主要研究方向:动物繁育与生物技术。E -mail :ylg@mail. hzau. edu. cn

基金项目:上海市科技兴农重点攻关项目, 农科攻字(2002) 第1-3-6号

星DNA 的重复顺序可以不同也可以相同。2　微卫星DNA 的检测方法及应用

位、QT L 分析、尤其在法医学领域普遍得到应用。

Craw ford 等人在1992年发表了第一个用微卫星

由于聚合酶链式反应(PCR ) 技术的完善和分子生物学技术的发展, 对微卫星DNA 的检测出现了多种方法, 总之表现为其检测成本降低、检测程序的标准化程度提高、灵敏度提高。目前主要有以下几种方法:211　DNA 指纹图谱法

标记构建的绵羊基因组连锁图谱;1995年发表了由常染色体构建的连锁图, 其中微卫星标记246个[9]。1998年由G ortari D 等出版的绵羊基因组第二代遗传

连锁图谱中共有519个标记, 其中504个为微卫星标记, 连锁图谱长3063cM , 覆盖了全基因组的80%以

上, 平均614cM 就有一个标记[10]。G eorge 等(1995) 在黑白花奶牛中利用基因图谱中的159个微卫星标记进行定位, 发现9号染色体上有一个显著提高奶牛产量的QT L , 第6号和第20号染色体上各有一个能增加产奶量但使乳脂率和乳蛋白降低的QT L , 第1号染色体和第10号染色体上也分别存在影响奶成分的QT L [11]。213　根据不同位点的微卫星DNA 有相同重复序列单位的特点, 用一种核心重复序列制成探针, 可以检测到许多不同位点的微卫星, 经S outhern 杂交, 放射自显影在X 胶片上显现DNA 指纹图谱, 该图谱不表示任何特定微卫星位点, 而是许多微卫星位点的集合状态。每个个体至少可显出18条以上的带纹, 并且有高度的个体特异性, 并且这些条带以孟德尔遗传方式在亲代间传递[4]。该技术可用于物种间遗传距离分析, 从而确定亲缘关系、预测杂交优势及品系纯度鉴定等研究领域。

K uhnlein 等采用M 13DNA () 是近几年, 此法先以PCR DNA 片段为基础, 然后利用该技术分离分析。毛细管电泳法主要是快速、微量、分辩率高、重复性好、易于定量和适合自动化检测等优点。该技术能在20分钟内分离长达几千K b 和DNA 片段, 对于外显子大小的DNA 片段, 其分辨率可

获得了5谱, 结果显示, 5个[5]。孟安明等对北京白鸡9个品系的样品进行DNA 指纹分析, 用条带的变异系数来衡量各系间的亲缘关系, 得到9个品系的聚类关系图; 同时对9个品系的配合力进行测定, 发现其生产性能全面反映了指纹图谱所作的预测[6]。

Buitkam p J 等用11个合成的探针与牛基因组DNA (用限制性内切酶Hin fl Alul Hae 消化) 杂交, 其中2个探针可以为3个德国品种牛分析DNA 指纹模式。计算参数及每个个体的平均条带数、两个无关个体的相同指纹概率, 不同的品种, 多态条带在11～23, 两个无关个体相同条带的计算概率在115×1027～2. 4×1027[7]。因此,DNA 指纹技术对个体识别有很高的精确度, 是一种十分有用的亲子鉴定方法。K ashiY 等利用小卫星探针Jefferys -33. 6, K NT2. 7和多聚TG 微卫星序列成功鉴定了犊牛的双亲[8]。212　聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法

达1bp 。该技术目前主要应用于核酸定量、基因突变的检测、遗传病诊断等方面, 它与PCR 和其他技术的结合将会有逐渐取代传统的琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的趋势。随着激光检测仪的引入, 将会进一步提高分析灵敏度及分辨率。但由于该技术对设备和成本要求较高, 在许多领域还未得到应用。

目前该技术主要用于人类疾病的检测,T Warren 采用微卫星-PCR 和毛细管电泳技术在人类基因组中发现了一个3bp 的重复单位, 当其重复数目超过正常值时就可导致Huntington 氏疾病的发生[12]。庄启南等人应用毛细管电泳技术对人类基因组进行扫描, 结果证明无论是PCR 效率还是基因型分辨率都比平板电泳效果好[13]。同时该技术还用于检测微卫星位点多态性差异, 这一技术适用于基因作图、尤其是多基因疾病的基因定位和法医学检验中。214　PCR -RF LP 检测法

PCR -RF LP 方法就是以特定微卫星位点侧翼区

根据微卫星两端的侧翼互补序列合成引物, 然后用PCR 扩增出长度不同的片段, 这种PCR 扩增的不同长度片段用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳来区分, 最后用银染得到结果。该法的分辨率、灵敏度明显高于琼脂糖电泳、放射自显影方法, 且操作时间短, 在凝胶中还可以加入诸如尿素等变性剂来减少异源双链的形成。目前该技术在基因图谱构建、基因定互补序列合成引物, 进行微卫星DNA 位点的扩增, 然后再用已知的限制性内切酶消化扩增产物, 消化后的片段通过凝胶电泳分离, 并形成连续谱带, 直接根据电泳条带进行分析[14]。与其它检测技术相比,RF LP

检测数量大, 可以根据电泳图谱直接分型, 非等位基因不存在上位效应。该技术已经广泛用于基因检测、定位和群体遗传学研究中。

陈克飞等(1997) 人以ESR 基因为猪产仔数候选基因, 对不同品系猪种进行酶切RF LP 分析, 结果发现4种不同的多态型, 结合系谱分析就可以找到ESR 基因的突变情况, 为进一步定位高产仔数基因创造条件[15]。刘铁铮(1999) 等人用PCR -RF LP 技术对147头猪进行氟烷基因的检测, 结果发现杂合子猪中有氟烷基因阳性, 首次证明了氟烷基因表型并非与基因型完全对应现象的存在[16]。

215　多重PCR 微卫星荧光标记全自动基因组扫描

学、生物化学、分子生物学等许多学科的科学家, 随着人类基因图谱的完成和高精密度标记在基因组中的

定位以及学科之间的相互渗透, 相信在不久的将来会有重大突破, 并且在疾病监控和动物育种中得到日益广泛的应用。

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多重PCR 技术是指在同一PCR 反应体系中对同

一样本采用多种引物同时进行扩增。目前由Perkin-Elmer 公司推出的微卫星荧光标记全自动基因分型技术已被普遍采用, 利用FAM 、TET 和HE M 三种不同颜色的荧光染料标记微卫星DNA 引物, 同荧光标记和不同扩增片段的PCR 孔中电泳, 准同时上样, GE NESC AN 等软件进行图象分析, 小。该方法具有产量高、成本低、快速简便等优点, 将为群体遗传学、QT L 筛选等大工作量的研究提供广阔的应用前景。

况少青(1998) 等人采用该技术建立了一种以T aq Start T M 抗体为酶保护剂、退火温度在一定范围内递降的多重PCR 体系, 结果表明在对人类基因组大规模扫描中多个微卫星位点可以同时得到扩增, 且电泳条带清晰[17]。1996年国际动物遗传学会和国际纯血马登记委员会(IS BC/IS AG ) 进行纯马国际标准化检验, 测试结果表明:采用12个微卫星标记和多重PCR 技术, 在已知母马微卫星多态型和未知情况下其父权否定概率分别为99195%和9816%[18], 从而为马匹的亲缘关系鉴定提供了一种快速有效的方法。3　问题与展望

虽然微卫星DNA 的研究近年来已取得了明显进展, 但作为一种普遍的遗传现象, 还有许多问题有待阐明, 如导致微卫星DNA 突变或重复序列不稳定性的分子机理不清楚; 动态突变和某些疾病发生机理不清楚; 微卫星在基因组中的作用不清楚等。

目前国内外对上述问题的研究已有一些进展, 但离完全阐明还相距甚远。这些问题已经吸引了遗传

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som atic cell hybridization in plants

LIU Y ong-hai ,Y U Le

(Department of Biology ,Zhaoqing C ollege ,Zhaoqing ,526061,China )

Abstract :Advances on s omatic hybridization as well as its history and development in plants were reviewed. M oreover advances and problems on asymmetric s omatic hybridization and gametos omatic hybridization in recent years were als o discussed.

K ey w ords :s omatic cell ;asymmetric hybridization ;plants

(上接3页)

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Microsatellite structure and its application of detection techniques

G UAN Feng 1,Y ANG Li-guo 2,J IA Ming-wei 1,CHENG Rui-he 1,MAO Da-gan 1

(1. Institute of Animal Breeding &Reproduction ,Nanjing Agricultural University ,Nanjing ,210095,China 2. C ollege of Animal Science and T echnology ,Huazhong Agricultural University ,Wuhan ,430070,China )

Abstract :Microsatellite marker was a kind of new m olecular marker in recent years ,and it was widely applied in animal breeding as an assistant selecting marker method because it had many merits such as convenient detection , high polym orphism ,codominance in genetics , Mendel genetic law -followed and g ood repetition. Microsatellite structure ,traits and detection techniques were reviewed to provide reference for its extensibility and utilization.

K ey w ords :microsatellite ;detection techniques ;application