霍山石斛多糖对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用

霍山石斛多糖对四氯化碳致急性肝损伤

小鼠的保护作用

122222*

黄静，李胜立，赵宏伟，潘利华，孙撬撬，罗建平

(1. 合肥工业大学校医院，安徽合肥230009;

2. 合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009)

［摘要］目的:研究霍山石斛多糖对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用。方法:80只小鼠随机分为8组，分别为正100，50mg ·常对照组、模型对照组、右旋糖酐对照组、淀粉对照组、多糖全水解产物对照组、霍山石斛多糖高、中、低(200，

－1

kg －1) 剂量组，每组10只，各给药组预防给药15d ，第15天给药结束后灌胃50%(用橄榄油稀释) 的CCl 4(1. 5mL ·kg BW ) ，

MDA 含量，建立急性肝损伤模型，连续给药2d ，每天1次。测定小鼠血清ALT 和AST 及肝匀浆中SOD ，免疫组化法观察肝细HE 染色观察肝脏病理组织学变化。结果:霍山石斛多糖各剂量组均能降低CCl 4致小鼠急性肝损伤血α表达水平，胞中TNF-AST 的升高，清ALT ，降低肝匀浆中MDA 含量，增强SOD 的活性，抑制肝细胞中TNF-α表达，减轻CCl 4对肝组织的病理损伤。结论:霍山石斛多糖对CCl 4致小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用，其保护机制可能与清除自由基，抑制脂质过氧化，抑制TNF-α表达有关。

［关键字］霍山石斛多糖; 四氯化碳; 急性肝损伤

霍山石斛Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng 属于兰科石斛属，主要产于安徽霍山地是药用石斛中的珍品，具有明目清喉、养胃清热、区，

生津止渴、抗辐射、抗衰老等多种功效，还具有降低心率、减慢呼吸等作用

［1］

门冬酸氨基转移酶(AST ) 、氧化物歧化酶(SOD ) 、丙

二醛(MDA ) 试剂盒均购自南京建成生物工程研究FITC 二抗均购所; 兔抗鼠TNF-α一抗、羊抗兔IgG-自武汉博士德生物工程有限公司; 其他试剂均为分析纯。

1. 2动物

SPF 级♂昆明种小鼠，体重(20ʃ 2) g ，

。现代药理研究证明，多

糖是霍山石斛发挥药理活性的主要成分，具有抗氧

化、治疗白内障、调节机体免疫功能、提高机体杀伤，但有关霍山石斛多糖对肝损伤的保护作用尚未见报道。本文采用CCl 4致小肿瘤细胞能力等活性

鼠急性化学性肝损伤模型，对霍山石斛多糖保护急性肝损伤的作用进行研究。11. 1

材料

药品与试剂霍山石斛多糖由本实验室提供，右旋糖酐T20购自都莱生物技术有限公司，淀粉购自宜兴市江山生物科技有限公司，四氯化碳购自天津市大茂化学试剂厂，丙氨酸氨基转移酶(ALT ) 、天

［稿件编号］[1**********]

［基金项目］国家自然科学基金项目(20872024) ; 合肥工业大学大学生创新实验计划项目(2011CXCY385) ［通信作者］［作者简介］

*

［2］

购自安徽医科大学动物实验中心，合格证号SCXK

(皖) 2011-002。1. 3

V1100型可见光分光光度计(上海美谱

达仪器有限公司) ; 7890A /5975C型气质联用分析

仪器

仪(安捷伦科技有限公司) ; Nicolet 67傅里叶红外光谱仪(美国Thermo Nicolet 公司) 。22. 1

方法

霍山石斛多糖的制备取1kg 霍山石斛鲜材料，按照1ʒ 3的料液比，在70ħ 条件下搅拌浸提2h 后离心，得上清液，重复提取2次，合并2次所得上清液，用80%的乙醇沉淀24h ，离心取沉淀，用蒸馏水溶解沉淀，采用Sevag 法脱蛋白，透析(MWCO :3000Da ) 24h ，然后减压浓缩至膏状，冷冻干燥得霍山石斛粗多糖，平均提取率为4. 35%。2. 2理化性质的测定2. 2. 1

水分和灰分的测定

100ħ 下常压烘干，称

量，测定霍山石斛多糖的水分含量; 采用马弗炉灼烧

罗建平，教授，博士生导师，博士，主要从事中草药与

E-mail :jianpingluo@yahoo. com. cn 功能食品研究，

黄静，中级主管技师，主要从事生化和临床检验，

E-mail :huangjing7058@yahoo. com. cn

·528·

法测定灰分含量。

2. 2. 2碳水化合物含量的测定

取适量多糖水溶

4ħ 生理盐水按照质量比1ʒ 9制备10%肝匀浆，4ħ 3500r ·min －1离心10min ，取血清上清，按试剂盒说明测定SOD 活性及MDA 含量。

2. 3. 3肝脏组织的病理切片观察取小鼠右叶相同位置肝组织，用4ħ 生理盐水冲洗后，滤纸拭干，浸泡与10%中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，常规切片，苏木素-伊红(HE ) 染色，光镜下观察肝组织切片的病理变化。2. 3. 4

免疫组化测定肝组织中TNF-α的表达肝PBS 冲洗后用0. 4%组织石蜡切片常规脱蜡、水化、胃蛋白酶盐酸溶液在37ħ 下修复抗原30min ，再用

PBS 冲洗3次，每次5min 。用10%正常山羊血清封4闭，室温孵育30min ，滴加混合好的兔抗鼠TNF-α，ħ 过夜，用测定TNF-α的试剂盒染色，光学显微镜下观察。2. 4

统计学处理采用SPSS 13. 0统计软件进行统计学分析，结果以x 珋ʃ s 表示，组间比较采用方差

液，以葡萄糖为标准品，按蒽酮-硫酸法比色测定总

糖含量。2. 2. 3

可溶性蛋白含量的测定取适量多糖水溶

液，以牛血清蛋白为标准品，按考马斯亮蓝法比色测

定蛋白含量。

2. 2. 4糖醛酸含量的测定［3］

－1

取0. 1g ·L 的霍

山石斛多糖样品溶液0. 15mL ，加蒸馏水至0. 25mL 。在冰浴中加入1. 5mL 四硼酸钠硫酸试液，混

匀，沸水浴加热5min ，迅速冷却至室温，加25μL 间羟联苯试液，摇匀，测定520nm 处吸光值，绘制标准曲线并根据标准曲线计算样品中糖醛酸含量。

2. 2. 5单糖组成分析［4］取5mg 霍山石斛多糖样

－1

品，溶解于4mL 2mol ·L 的三氟乙酸中，置于10mL 安培管中，120ħ 水解4h ，酒精喷灯封管，减压

蒸干，加3mL 甲醇继续蒸干，重复加甲醇4 5次，除尽残留的三氟乙酸。将完全水解的霍山石斛多糖样品溶解于3mL 蒸馏水中，加30mg 硼氢化钠，室温还原3h ，用25%的醋酸中和过量的硼氢化钠，到溶液不再产生气泡为止，减压蒸干，加3mL 甲醇蒸干，重复加甲醇4 5次除去硼酸及水分，在50ħ 真120ħ 烘箱15min 充分除去水空干燥箱中干燥5h ，

100ħ 反应1分，加3mL 乙酸酐和3mL 吡啶，密塞，h ，MS 分析。减压蒸干后用三氯甲烷萃取，进行GC-2. 2. 6

红外光谱分析取一定量样品与溴化钾研－1

磨均匀压片，在4000 400cm 扫描霍山石斛多糖。

霍山石斛多糖对肝损伤的影响

动物分组及给药将小鼠随机分为8组，每

组10只，分别为:正常对照组、模型对照组、右旋糖

分析。

3结果3. 13. 1. 1

霍山石斛多糖理化性质的测定

霍山石斛多糖的组成成分分析霍山石斛

80%乙醇沉淀、Sevag 法脱蛋白、经70ħ 水提、透析(MWCO :3000Da ) 24h 、冷冻干燥后得到霍山石斛多糖，其碳水化合物质量分数为83. 285%，糖醛酸

质量分数为3. 547%，蛋白质质量分数0. 418%，水2. 657%; 同时分和灰分质量分数分别是1. 918%，红外光谱分析显示(图1) ，霍山石斛多糖在3450cm －1处具有强的O-H 伸缩振动吸收峰，在2900

－1

cm －1处具有C-H 键伸缩振动吸收峰，在1070cm O-C 环内醚的C-O 伸缩振动和附近具有分子内C-－1

C-O-H 的O-H 变角振动，D -在890cm 处具有β-吡

－1

D -喃葡萄糖苷吸收峰，在870cm 处具有β-甘露吡喃糖苷吸收峰，这些结果均说明被分析物质主要为

2. 32. 3. 1

酐对照组、淀粉对照组、多糖全水解产物对照组、霍

100，50mg ·kg －1，山石斛多糖高、中、低(200，折合2. 30，1. 15g ·为霍山石斛干材料分别为4. 60，

kg －1) 剂量组，各给药组预防给药15d ，第15天给药结束后灌胃50%(用橄榄油稀释) 的CCl 4(1. 5mL ·kg －1BW ) ，建立急性肝损伤模型，连续给药2d ，每

16h 后心脏取血，天1次。末次给药后禁食，并分离小鼠肝脏，检测各项生化指标。

2. 3. 2生化指标的测定小鼠血样4ħ 3500r ·min －1离心10min ，取血清，自动生化分析仪检测血AST 的活性。取肝脏相同部位的肝组织，清ALT ，用

多糖类化合物。

3. 1. 2霍山石斛多糖的单糖组成分析

霍山石斛

多糖经三氟乙酸全水解、硼氢化钠还原、乙酸酐酯化

MS 分析，为糖醇乙酸酯后用GC-解析总离子流色谱图上每个色谱峰所对应的MS 谱，结果显示保留时

17. 104，17. 404，17. 489min 的色谱峰间为13. 386，

对应的物质分别为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖，其Man-Gal-Xyl =16. 513ʒ 1. 000ʒ 4. 216ʒ 摩尔比为Glc-1. 785。

·529·

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月

Vol. 38，Issue 42013February ，

组织中SOD 的活性均明显升高(P ＜0. 05或P ＜

0. 01) ，MDA 的含量明显降低(P ＜0. 05或P ＜0. 01) ，右旋糖酐对照组、淀粉对照组、多糖全水解产物对照组对CCl 4所引起的肝组织中SOD 活性的降低及MDA 含量的增加没有显著的影响(表2) 。

表2

石斛多糖对CCl 4肝损伤小鼠肝组织SOD 活性及MDA Effects of DHP on the levels of liver SOD and MDA in

含量的影响

图1Fig. 1

霍山石斛多糖的红外光谱图

FT-IR analysis of function group in DHP

Table 2

CCl 4induced acute liver injury mice (x ʃ s ，n =10) 珋

组别

剂量/mg·kg －1BW

－－[**************]50

SOD /U·mg －1151. 19ʃ 0. 98137. 38ʃ 1. 87

139. 03ʃ 1. 81137. 88ʃ 1. 83137. 58ʃ 2. 07152. 20ʃ 2. 29

3) 1)

MDA /μmol ·g －14. 83ʃ 0. 068. 60ʃ 0. 071) 8. 29ʃ 0. 098. 61ʃ 0. 068. 58ʃ 0. 076. 20ʃ 0. 113) 6. 81ʃ 0. 073) 7. 69ʃ 0. 082)

3. 2

霍山石斛对CCl 4肝损伤的保护作用

3. 2. 1霍山石斛多糖对CCl 4肝损伤小鼠血清中CCl 4肝与正常对照组比较，

AST 的活性明显升高(P ＜损伤模型组小鼠ALT ，

0. 01) ，说明CCl 4致小鼠急性肝损伤造模成功(表1) 。与模型组比较，石斛多糖各剂量组均能显著降AST 的升高(P ＜0. 05或P ＜低CCl 4所引起的ALT ，0. 01) ，且具有浓度依赖性，右旋糖酐对照、淀粉对照组、多糖全水解产物对照组对CCl 4所引起的ALT ，AST 的升高没有显著的影响。

表1

AST 活霍山石斛多糖对CCl 4肝损伤小鼠血清中ALT ，Effects of DHP on the activities of serum ALT and AST

正常模型右旋糖酐淀粉

DHP 水解DHP

ALT ，AST 活性的影响

150. 64ʃ 1. 412)

147. 60ʃ 1. 22

3. 2. 3

各实验组肝损伤病理切片观察正常对照

组小鼠肝小叶结构完整，肝索呈放射状排列，整齐而有规则，肝细胞结构及形态正常，细胞排列整齐，大小均匀，分界清楚，细胞核大而圆，核质分布均匀，核仁清晰。CCl 4肝损伤模型对照组及右旋糖酐对照组、淀粉对照组、多糖全水解产物对照组小鼠部分肝小叶结构破坏，肝细胞普遍浊肿，索状排列紊乱，出现以中央静脉为中心的局灶性肝细胞变性、坏死或细胞核固缩溶解，大量炎细胞浸润。霍山石斛多糖各剂量组小鼠肝细胞病理损伤程度明显减轻，肝小叶结构基本完整，肝细胞排列比较整齐，肝细胞肿胀、变性坏死程度减轻，坏死灶区明显减少，炎性细

性的影响Table 1

ʃ s ，n =10) in CCl 4induced acute liver injury mice (x 珋

组别正常模型右旋糖酐淀粉

DHP 水解DHP

剂量/mg·kg －1BW

－－[**************]50

注:1) 与正常组比较P ＜0. 01; 组比较P ＜0. 01(表2同) 。

2)

ALT /U·L －130. 67ʃ 1. 55

AST /U·L －179. 55ʃ 2. 45

93. 67ʃ 5. 231) 107. 99ʃ 2. 221) 87. 39ʃ 5. 55105. 13ʃ 4. 3392. 62ʃ 3. 0791. 79ʃ 2. 6845. 95ʃ 2. 2265. 28ʃ 2. 50

3) 3)

107. 75ʃ 2. 55106. 94ʃ 4. 4785. 20ʃ 1. 98

3)

88. 80ʃ 1. 143) 92. 94ʃ 2. 122)

83. 75ʃ 2. 682)

胞浸润程度也明显较低(图2) 。

3. 2. 4各个实验组小鼠肝组织TNF-α的表达肝

组织表达TNF-α的免疫组化结果显示，正常对照组CCl 4肝损伤模型小鼠肝脏中几乎没有TNF-α表达，

对照组及右旋糖酐对照、淀粉对照组、多糖全水解产物对照组小鼠肝脏中TNF-α呈强表达，霍山石斛多糖各剂量组肝组织表达TNF-α的量明显减弱(图3) 。4讨论

CCl 4肝损伤模型组小鼠肝组本实验结果显示，

织破坏严重，组织病理学观察证实肝小叶结构破坏，

3)

与模型组比较P ＜0. 05，与模型

3. 2. 2

霍山石斛多糖对CCl 4肝损伤小鼠肝组织

SOD 活性及MDA 含量的影响与正常对照组比

CCl 4肝损伤组小鼠SOD 活性明显降低(P ＜较，0. 01) ，MDA 含量明显升高(P ＜0. 01) ，与模型组比较，石斛多糖高剂量组、中剂量组、低剂量组小鼠肝·530·

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A. 正常组; B. 模型组; C. 右旋糖酐组; D. 淀粉组; E. 多糖全水解产物组; F. 多糖高剂量组; G. 多糖中剂量组; H. 多糖低剂量组(图3同) 。

图3Fig. 3

各实验组小鼠肝组织表达TNF-α的免疫组化图(HE ) The results of mouse hepatic tissues expressing TNF-α

图2Fig. 2

各实验组小鼠肝组织病理切片图(HE ) Histopathological observation results (HE )

measured with immunohistochemistry (HE )

肝细胞普遍浊肿，变性，坏死或细胞核固缩溶解，大

AST 显著升高。霍山石斛量炎细胞浸润，血清ALT ，多糖各剂量组小鼠肝细胞受损程度明显减少，血清ALT ，AST 水平显著低于CCl 4损伤组，且具有浓度依赖性，表明霍山石斛具有保护肝细胞膜，对抗肝损伤

的作用。而右旋糖酐对照，淀粉对照组，多糖全水解AST 的升高没有产物对照组对CCl 4所引起的ALT ，

显著的影响，说明霍山石斛多糖对四氯化碳肝损伤的保护作用具有结构特异性。

CCl 4肝损伤组小鼠比正常组小鼠在本实验中，

MDA 含量明肝组织SOD 活性明显降低(P ＜0. 01) ，

说明细胞清除自由基的能力降显升高(P ＜0. 01) ，

低、细胞膜受损程度严重，而霍山石斛多糖可显著提

高各保护组肝组织中SOD 活性，降低MDA 含量，说明霍山石斛多糖能够较好地提高细胞清除自由基的能力，减轻细胞膜在自由基等攻击下的损伤程度

。

而右旋糖酐对照、淀粉对照组、多糖全水解产物对照

组对CCl 4所引起的肝组织中SOD 活性的降低及MDA 含量的增加没有显著的影响，进一步说明霍山石斛多糖的保肝活性具有结构特异性。

此外，在自由基的作用下，单核细胞和巨噬细胞被激活，产生大量的细胞因子如肿瘤坏死因(TNF-TNF-α) 等，α具有多种生物活性，既可以刺激细胞产生凋亡刺激因子，在转录终止水平诱导小鼠肝细胞凋亡，还可以诱发中性粒细胞向内皮细胞黏附或活化中性粒细胞，促使其趋化聚集于肝脏释放氧自

［5-6］

。本实验免由基或蛋白酶，造成肝细胞毒性损伤疫组化结果显示，正常对照组小鼠肝脏中几乎没有

TNF-CCl 4损伤模型对照组及右旋糖酐对照α表达，组、淀粉对照组、多糖全水解产物对照组小鼠肝脏中

TNF-α呈强表达，霍山石斛多糖各剂量组肝组织表达TNF-α的量明显减弱，对肝细胞损伤有明显的改善作用，说明霍山石斛多糖对CCl 4致小鼠急性肝损

·531·

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伤的保护作用与其抑制肝组织TNF-α的产生，减轻

炎症反应有关。

综上所述，霍山石斛多糖对CCl 4肝损伤具有保护作用，且具有结构特异性，其保护机制可能与清除自由基，减轻脂质过氧化，保护肝细胞膜结构和功能的完整性; 提高肝细胞内SOD 活性，增强机体抗氧化能力; 减少肝组织内TNF-α过度表达而诱发的炎症反应有关。

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. 时珍国医国药，2009，20(3) :657. 作用研究［J ］

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. Biochem Bio-cholestasis-induced liver fibrosis in the mouse ［J ］phys Res Commun ，2009，378(3) :348.

Protective effects of polysaccharides from Dendrobium huoshanense on

CCl 4-induced acute liver injury in mice

HUANG Jing 1，LI Sheng-li 2，ZHAO Hong-wei 2，PAN Li-hua 2，SUN Hao-qiao 2，LUO Jian-ping

(1. Hospital of Hefei University of Technology ，Hefei 230009，China ;

2. School of Biotechnology and Food Engineering ，Hefei University of Technology ，Hefei 230009，China )

［Abstract ］Objective :To study the protective effects of polysaccharides from Dendrobium huoshanense (DHP ) against CCl 4-induced liver injury in mice. Method :Eighty male Kunming mice were randomly divided into normal control group ，model control group ，dextran control group ，starch control group ，hydrolyzate control group ，three different dose of DPH groups consisting of high-dosage group ，middle-dosage group and low-dosage group (200，100，50mg ·kg －1) . Each group contained ten mice. The mice were treated with DHP via intragastric administration for 15days before treatment of 50%CCl 4in olive oil for consecutive two days. Both al-anine aminotransferase (ALT ) and aspartate aminotransferase (AST ) activities in serum and superoxide dismutase (SOD ) activities and malondialdehyde (MDA ) contents in liver tissues were determined in all groups. Immunohistochemistry was used to detect the ex-pression of TNF-αin hepatic tissue. Hepatic histopathological examination was observed. Result :DHP effectively decreased the activi-ties of ALT and AST in serum and the contents of hepatic MDA ，and restored hepatic SOD activities in acute liver injury mice. Liver tissue damage induced by CCl 4was ameliorated in mice with DHP administration through histopathology examination. Furthermore ，the expression of TNF-αwas greatly decreased in groups treated with polysaccharides. Conclusion :DHP has a significantly hepatoprotec-tive effect on CCl 4-induced acute liver injury in mice. Protective effect of DHP on the liver may be related to its function of scavenging free radicals and inhibiting lipid peroxidation and TNF-αexpression.

［Key words ］Dendrobium huoshanense polysaccharide ; CCl 4; acute liver injury

2*

doi :10．4268/cjcmm20130413

［责任编辑

吕冬梅］

·532·