高效液相色谱仪基本结构及使用
仪器原理与使用
PRINCIPLE AND OPERATION OF INSTRUMENT
定的流出液。1.3.2 恒流泵
恒流泵的主要功能是输出的流量恒定,如往复柱塞泵、螺旋传动注射泵等。往复柱塞泵与恒压泵不同,通常采用电驱动活塞,当活塞迅速向上动时,由于减压使入口止逆阀开启,出口止逆阀关闭,贮液器中的流动相被吸入柱内,形成一个循环,然后再开始下一个循环。使用这种泵时一定要连接脉动阻尼器,将产生的脉动除去,若采用双活塞泵,使双活塞在相移180°下工作,可使脉动互相抵消,减小噪声。往复柱塞泵的流量与外界阻力无关,恒流泵具有体积小的特点,非常适合于梯度洗脱。1.3.3 螺旋传动注射泵
螺旋传动注射泵是用电力以很慢的恒定速率驱动活塞,使流动相连续输出,当活塞到达末端时,输出中止,然后由另一个吸入冲程使溶剂重新充满再开始第二次输出,输出时间的长短决定于泵腔体积及输出流量。1.4 梯度洗脱
梯度洗脱是在分离过程中通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力的一种方法。通过梯度装置将两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱。梯度洗脱一般采用低压梯度的方法,低压梯度采用低压混合设计,只需要一个高压泵在常压下将两种或两种以上溶剂按一定比例混合后再由高压泵输出,梯度的改变可呈线性、指数型或阶梯型。1.5 进样器
高效液相色谱仪进样器普遍使用高压进样阀,用微量注射器将样品注入样品环管,使用的样品环管分别有不同的尺寸,可根据分析要求选用。当进样阀手柄放在吸液位置时,流动相直接通过孔的通路流向色谱柱,样品通过注射器从另外的位置进入样品环管,如果有过量的样品则会从出口孔排出,然后将手柄转到进样位置,此时流动相便将样品带进了柱子。1.6 色谱柱
色谱柱是整个色谱系统的心脏,它的质量优劣直接影响到分离的效果,一般情况下色谱柱通常采用优质不锈钢管制成,并且柱内壁必须光洁平滑,否则内壁的纵向沟痕和表面多孔性也会引起谱带的展宽,柱接头的体积应尽可能小,柱长一般为10 cm ~25cm,内径4 mm ~5mm。若使用直径为5μm~10μm固定相颗粒,理论塔板可达到5×104/m。尺寸排阻色谱柱的内径通常大于5mm,制备色谱柱则会更大;为了减少溶剂用量,可采用微径柱,内径为1mm,长度为30 mm ~75mm,若采用3μm颗粒,理论塔板数高达1×105/m。为了保护分析柱不被污染,有时需在分析柱前加一短柱,约数厘米长,此柱称为卫柱,为了防止卫柱过分增加柱阻力,在卫柱中使用的颗粒大小约为10μm ~30μm。1.7 检测器
高效液相色谱仪常用的检测器有紫外吸收、示差折光率、荧光和安培检测器等,对它们的要求和性能指标与气相色谱检测仪基本相同。检测器主要分为紫外吸收检测器、荧光检测器和示差检测器。1.7.1 紫外吸收检测器
紫外吸收检测器是一种选择性浓度型检测器,它不仅对那些在紫外波长下有吸收的物质有响应,并且还具有灵敏度高、噪声低等优点,在高效液相色谱中应用最广,约占70%。
紫外吸收检测器通常采用氘灯作光源,氘灯发射出紫外线并在可见区范围内可以进行连续的辐射,同时安装一个光栅型单色器,通过扫描获得所需的工作波长,检测器它有两个流通池,一个作参比用,一个作测量用,光源发出的紫外光照射到流通池上,若两流通池通过纯的均匀溶剂,它们在紫外波长下几乎无吸收,光电管上接收到的辐射强度则相等,无信号输出;当组分进入测量池时,吸收一定的紫外光,使两光电管接受到的辐射强度不等,这时有信号输出,输出信号的大小与组分浓度有关,紫外吸收检测器的灵敏度很高,许多功能团在紫外区具有很高的摩尔吸收系数,若采用可调波长的氘灯作光源,在组分的最大吸收波长处进行检测,其检测灵敏度可达0.002AUFS(满刻度吸收单位),最小检测量为几个ng。紫外吸收检测器适用于梯度洗脱,对流动相速度变化不敏感,流动相组成的变化对检测响应几乎无影响,但是只有在检测器所提供的波长下有较大吸收的分子才能进行检测,而且流动相的选择会受到一定限制,即具有一定紫外吸收的溶剂不能作流动相。每种溶剂都有紫外截止波长。当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时,溶剂的透光率才能降到10%以下。因此检测器的工作波长不能小于溶剂的紫外截止波长。从氘灯发出的紫外-可见辐射穿过光闸,光闸是惟一可以移动的部件,它用于暗电流的测量和波长的校正,此辐射不经分光直接通过吸收池、狭缝至衍射光栅经光栅分光的辐射分别投射到约千个二极管阵列的检测器上,约10ms 可以测出一次信号,获得数据如此高速,可以使保留时间极短的色谱组分的光谱图不失真,固定光栅和二极管阵列可以消除因机械传动的不确定性而带来的误差,并且此数据的重现性好,灵敏度高,适用于痕量分析,这种检测器的最大优点是可以同时获得吸收值,其保留时间和波长函数图类似于等高线的三维图。由于可以同时获得多种信息,使每个组分在整个波长范围内的光谱信息将会增加,而且可以及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据,从而迅速决定具有最佳选择性和灵敏度的波长,它可以与色谱工作站联用,通过评估程序可以从比较光谱图获得样品纯度的信息,而且可对每一个峰从程序库中进行检索来确定该化合物。1.7.2 荧光检测器
荧光检测器是一种最灵敏的高效液相色谱检测器。它属
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于选择性浓度型检测器,光源发出的光束通过透镜和激发滤光片,分离出特定波长的紫外光,此波长称为激光波长,再经聚焦透镜聚集于吸收池上,此时荧光组分被紫外光激发而产生荧光,在与光源垂直的方向上经聚焦透镜与荧光聚焦,再通过发射滤光片分离出发射波长,并投射到光电倍增管上,荧光强度与组分浓度成比例,荧光检测器的灵敏度比紫外吸收检测器约高二个数量级,因此特别适合于痕量分析,非荧光物质可通过与荧光试剂反应变成荧光物质后再进行检测,使荧光检测器扩大了该检测器的应用范围。1.7.3 示差折光率检测器
示差折光率检测器是一种通用性检测器,只要组分折光率与流动相折光率不同,就能进行检测。反射型示差折光率检测器根据Fresnel反射定律设计,光源发出的光束分别投射到测量池和参比池上,其中有一部分入射光在液体和棱镜界面上就被反射出来,而另一部分则穿过液体后被棱镜底部的不锈钢板反射出来,投射到光电管上。由于流经参比池和测量池的液体的折光率不等,因此反射出来的两束光强就有差别,导致光电管产生信号。示差折光率检测器的通用性好,可以检测的化合物范围广 ,特别是在尺寸排阻色谱中用得较多。
2 液相色谱仪的进展
二维色谱联用技术主要是在二种色谱之间采用柱切换技术,用多通切换阀来改变色谱柱之间的连接和溶剂流向,实现将一根色谱柱上未分开的组分在另一根柱上用不同的分离原理加以完全分离,尤其适合复杂体系样品的分析。将样品的预处理、分离反应、检测、收集等一个实验室的功能聚集在一个小块玻璃或高分子聚合物芯片上,微流控芯片在芯片基质上蚀刻了各种管道和反应池。通过电渗透、微泵乃至离心等各种方法来实现分离,如测DNA 序列的芯片在3cm 距离内,只加20V/cm的电压就可在13分钟内测定40BP 的序列,分离度大于0.5,高于3000万理论塔板数/米。
随着计算机技术和信息科学在液相色谱技术中的广泛应用,结合人工智能技术能模拟某个领域内专家的思维过程,并且能够解决只有人类专家才能解决问题的智能计算机程序系统 。目前已有的各种色谱专家系统能推荐最佳柱系统(包
括分离模式、固定相、流动相、等条件)和色谱定性等内容。色谱工作站可以很方便地进行数据处理及仪器管理等工作,如鉴定色谱峰,计算出出峰的时间、峰高及峰面积,组分含量等,对检测结果作出定性及定量结论;还可以对仪器的工作过程、工作条件进行自动控制,如流量、压力、温度、检测条件控制等。
液相色谱仪以独特的特点及其技术的发展,已被广泛地应用到化工、食品分析、环境分析、天然产物分析以及医药、生化、临床检验,它对于疾病的诊断和疗效监测起到了非常重要的作用。如医药方面,高效液相色谱仪可以分析药物的含量,药物在体内的残留量,测定药物在体内的代谢情况等。在生化方面高效液相色谱仪可以分离分析与生命密切相关的多种物质, 如氨基酸、肽、蛋白质、核酸、维生素、酶、糖等。临床检验方面可以对疾病的变化通过对人体组织或体液中的异性物质进行含量改变的分析,对于疾病的诊断和疗效监测将会起到重要的作用。
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③参考文献格式: 例1. [1]陈玉勤,等.MSCTA(16层)成像技术应用探讨[J].医疗设备信息,2007,22(1)80. 例2. [2]李祖江. B超监护仪心电图机维修1200例[M]. 天津:海潮出版社, 2006.4) 稿件中如有附图,请将图片的源文件单独发送。
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