薄层层析法测定粮食中的黄曲霉毒素B1

　　摘要：简单介绍了国家标准《食品中黄曲霉毒素B1的测定》第一法――薄层层析法，并对该法中容易产生误差的操作步骤和难于理解的问题进行了详细的说明。 　　关键词：黄曲霉毒素B1；薄层层析法；说明 　　中图分类号：S816.7 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-01-0023-1 　　 　　0 前言 　　黄曲霉毒素（以下简称AFT）是黄曲霉和寄生曲霉产生的一类代谢产物，毒性极强，是目前已知的最强的化学致癌物之一。AFT对粮油食品的污染相当广泛，但很不均衡。在各类粮油及其制品中，花生、花生油、玉米污染严重，大米、小麦、面粉污染较轻，豆类则很少受到污染。天然污染的粮油食品中，AFTB1含量最大，且毒性和致癌性最强，故在粮油食品AFT的监测中常以AFTB1作为主要指标。 　　1 薄层层析法测定AFTB1 　　1.1 原理 　　利用AFTB1的溶解特性，将AFTB1从样品中提取出来，浓缩后于薄层板上分离，在波长356nm的紫外光下，AFTB1会产生蓝紫色荧光。根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定其含量。 　　1.2 特点及使用范围 　　该法是国家标准中第一法，是通过薄层色谱分离，目测比较样液与标液中AFTB1荧光强度来定量的。检出限为5µg/kg，回收率75%以上，适合各类粮油食品中AFTB1的测定。 　　1.3 测定 　　流程如下：试样制备→提取与净化→过滤→反萃取→脱水过滤→挥发浓缩→定量转移→点样→预展→正展→观察→确定试验→概略定量→结果计算 　　2 需说明的事项 　　2.1 样品采集与处理 　　粮油食品中的AFT分布极不均匀，尤其是玉米，稻谷等颗粒样品，为了得到可靠的分析结果，必须在样品扦取、制备过程中充分保证样品的代表性。 　　2.2 提取与净化 　　根据相似相溶原理，用石油醚-甲醇水系统振荡提取，AFTB1及醇溶性色素溶解在甲醇水相中，而绝大部分油脂和色素则进入石油醚相中被分离开来。 　　2.3 反萃取 　　将三氯甲烷加到甲醇水中，通过液液萃取法使AFT进入三氯甲烷层，而试样中的醇溶性杂质、色素等干扰物质则留在甲醇溶液中。这样做目的有两个：一是进一步净化提取；二是甲醇水沸点高，不易浓缩，也不能点板，故要萃取到三氯甲烷中。 　　2.4 脱水过滤 　　三氯甲烷萃取液中会含有少量水分，如不予处理，在下一步65℃水浴浓缩过程中，水分会留在蒸发皿上。所以标准中用盛装有无水Na2SO4的慢速定量滤纸脱水过滤时速度一定要慢。 　　2.5 定容 　　定容操作一定要小心迅速，以免苯-乙腈溶液挥发致使体积减少从而导致浓度发生变化而影响结果的准确性。 　　2.6 薄层板准备 　　薄层板使用前须在105-110℃下活化1h，保存在干燥器中。 　　2.7 点样 　　（1）在距底边3cm基线上点样，点与点间距1cm，点距板边缘3cm。（2）每点样液分多次滴加，点的直径尽可能小，以提高测定灵敏度。同一薄层板上，滴加斑点应大小一致，以保证测定结果的一致性。（3）滴加样液时，可边吹冷风边滴加，但要避免针尖上悬挂的液滴被吹干、没有滴加在薄层板上而使测量结果不能反映其真实含量。（4）点样要迅速，避免薄层板吸湿，活性下降。 　　2.8 无水乙醚预展 　　由于AFTB1不溶于乙醚，通过12cm无水乙醚预展，可将脂肪、杂质等与AFTB1分离开，起到除杂与净化作用。 　　2.9 丙酮正展 　　将展开槽三面衬以滤纸，倒入展开剂丙酮-氯仿，盖上盖子，静置5-10min，使展开槽内的空间被展开剂蒸汽充分饱和，再放入预展过的薄层板。展开槽的盖子一定要盖严，而且要保证展开槽热冷均匀。因为槽内即使有微小的温差，也可能导致前沿歪斜。 　　2.10 观察判断 　　紫外灯下观察，方法如下：首先找到第四点。第四点是定位点，该点中AFTB1含量最高，最易观察到。然后在第四点荧光点的位置上找第一点和第三点。第一点是最低检出量点，可检验薄层板好坏及色谱条件是否合适。若此点无荧光，可能是薄层板或色谱条件有问题。第三点是在样液上滴加AFTB1标准液，用来检查在样液内AFTB1最低检出量是否正常。若第一点有荧光，第三点无，则说明样液中可能有荧光猝灭剂，此时应检查样品提取系统。最后观察第二点。第二点为样点。在标准点相应位置观察此点有无蓝紫色荧光。若此点无，而其他点均有，则表明样品中AFTB1为阴性，含量在5µg/kg以下。有则需进行确证实验。 　　2.11 确证实验 　　为证实薄层板上样液点荧光系AFTB1产生，进行确证实验。 　　2.12 概略定量 　　样液中AFTB1荧光点的荧光强度如与AFTB1标准点的最低检出量（0.0004µg）的荧光强度一致，则样品中AFTB1含量即为5µg/kg。如样液中荧光强度比最低检出量点强，则根据其强度估计减少点样量或将样液稀释后再点样，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光点一致为止。 　　2.13 结果计算 　　 　　Ｘ=0.0004×――――-×1000 　　 　　X：样品中AFTB1的含量（µg/kg）；V1：稀释前样液的总体积（mL）；V2：出现同等荧光强度时稀释后样液点样量（mL）；D：样液稀释倍数；m：稀释前样液总量相当的样品质量（g）；0.0004：AFTB1最低检出量（µg）。 　　（1）最低检出量。一般认为，本法薄层的灵敏度即最低检出量为0.0004µg。但由于各实验室条件不同及操作人员的个体差异等原因，最低检出量可能略有不同，通常需要进行最低检出量测定，找出实验室自己条件下的最低检出量，以保证结果的准确性。（2）稀释倍数D。若标准中20µL样液的荧光强度恰好与最低检出量相同，则根据3.13计算公式可得每千克样品中AFTB1含量为： 　　 　　0.0004µg×―――――――×1000g=5µg 即5µg/kg。 　　 　　若标准中20µL样液的荧光强度比最低检出量点强，样液稀释D倍后的荧光强度与最低检出量点一致，则样液中AFTB1含量为5×Dµg/kg。 　　 　　参考文献 　　[1] 粮油质量检验员.中国轻工业出版社. 　　[2] 食品中黄曲霉毒素B1的测定.GB/T5009.22-2003. 　　 　　作者简介：窦玉平（1975－），女，河北人，中央储备粮通辽直属库工程师，研究方向：粮油检验和实验室质量管理。