肝癌H22石蜡切片的制作

石蜡切片法（一）

---------取材、固定、洗涤、脱水

一、 实验原理

材料的选择是制作切片的第一步，用于制片的动物、植物材料应选择新鲜的，用陈腐的材料制片，往往不能反映材料的真实情况。

固定就是将新鲜材料投入某类化学药液中，借助化学药品的作用使细胞组织的形态保存下来不使其改变形态和变质的过程。

材料经过固定液作用以后，内部渗入很多固定液，一定要把渗入里面的固定液洗去，否则留在材料中的固定液有的会妨碍染色，有的会发生沉淀或结晶，影响观察，有的继续作用，使材料变坏等。所以材料中的固定液必须彻底洗净。 材料经过洗涤后含有大量水分，必须用脱水剂脱尽里面的水分，以利于材料的透明和制片的保存，因为水在里面能使材料分解，而且透明剂与水是不相混合的，只有在完全无水的情况下，透明剂才能完全透入。

二、 实验用品

（一）器材

解剖刀，解剖针，解剖剪，镊子，解剖盘，培养皿，吸管。

（二）试剂

福尔马林-酒精-醋酸混合固定液（简称FAA），10％中性福尔马林，秦克（Zenker）氏液，卡诺（Carnoy）氏液，各级酒精（30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％）。

（三）材料

一般动物组织。

三、 实验程序

（一）取材

1. 取材的方法

取材应根据需要，用锋利的刀片从所需部位上切取一小块放在固定液中固定。动物组织的切片，厚度不超过3mm，体积不大于1.5×1.5×0.5cm。材料的选择和切取部位也很重要。

2. 取材的注意事项

（1） 取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变

化。

（2） 切取材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部

分。

（3） 切取病理材料时，应特别注意不能将有病的组织损伤，为了和正常无病组

织相区别，在取材时除了切取病理材料外，正常的组织也须切取一部分，以便作比较观察。

（二）固定

1. 固定的方法

取到新鲜材料，应按材料的种类、大小、性质和制作要求，立即将材料投入固定液加以固定，使其形态结构和成分被化学试剂固定下来，与生活时保持相仿。 小鼠肝癌组织固定于10％甲醛固定液中。

固定的时间，视材料的种类、大小、性质、固定液的种类与性质、渗透力的强弱

等而定，可以从1～2h到十几小时或二十几小时，甚至可以长至几天。一些小的材料，仅须几十分钟。如：兔肝固定于Zenker氏液或Carnoy氏液里，固定时间为12～24h。

2. 固定的注意事项

（1） 一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，

以免引起化学变化，失去固定作用。

（2） 有些混合固定液的成分之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混

合。如果混合太早，固定时就没有作用了。

（3） 固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20～30倍，有些水分多

的材料，中间应更换1～2次新液。

（4） 材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外贴上标

签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。

（三）洗涤

材料自固定液中取出后，须立即洗涤，所用的冲洗液应依固定液的性质而定。

1. 固定液为酒精或酒精混合液，一般不冲洗。若需洗涤则必须用与固定的酒精相近浓度的酒精冲洗。

2. 用含有苦味酸的固定液的材料（苦味酸与福尔马林混合的固定液除外），需要用70％的酒精反复浸洗。

3. 含有铬酸、重铬酸接的，必须用流水冲洗。冲洗时间应与固定时间相同或更长。

4. 用福尔马林固定的，一般可以不冲洗，但长期固定于福尔马林的材料应充分水洗。

5. 含四氧化饿的固定液用水冲洗。

6. 固定液含有氯化汞的，应根据溶剂的性质用水或酒精冲洗。

一般的洗涤方法，将材料放入指管或广口瓶，并加半管水，用纱布将管口扎住，然后倒置于水槽内，这样可以使指管半沉半浮于水中。打开水龙头，让材料按冲洗的时间在流水中冲洗。注意水流不能太急，以免冲坏材料。流水冲洗的时间可根据材料和固定液的情况而定，一般需要12～24h。

（四）脱水

1. 脱水的方法

脱水一般多使用酒精，为了不使材料急剧收缩，应用不同浓度的酒精，自低浓度到高浓度逐级脱水。一般的材料可以从30％的浓度开始，经50％、70％、80％、90％、95％直至纯酒精。在用纯酒精时，需要换2次（使彻底脱水）。对于一些薄嫰、柔弱的材料，可依次经10％、20％、30％……每级相差10％直至纯酒精。

在每级酒精中停留的时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液溶解性而定。一般动物组织如小白鼠的肾脏2～4mm厚，每级停1～2h。

2. 脱水注意事项

（1） 脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止吸收空气中的水分。

（2） 在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器

皿中的脱水剂，再用吸水纸吸尽器皿内剩余液，然后于器皿中加入高一级

脱水剂。

（3） 在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，负责易使组织变软，助长材料的解

体。

（4） 在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，

影响切片。

（5） 如需过夜，应停留在70％酒精中。

（6） 脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色浑浊现象。

石蜡切片法（二）

------透明、透蜡、包埋

一、 实验原理

材料在脱水以后，所用的大多数脱水剂（酒精、丙酮等）不能和石蜡相混合，而透明剂即可与脱水剂相混合又能和石蜡相混合，因而可通过透明剂的作用把脱水剂替换出来，使石蜡能顺利地进入材料中。当材料中全部为透明剂占有时，材料可呈现不同程度的透明状态。

蜡是将材料中的透明剂逐步清除，以致完全由石蜡充分渗透。

包埋就是把被石蜡浸透的材料连同熔化的石蜡，一起倒入一定形状的容器（如纸盒）内，并立即投入冷水中，使它立即凝固成含材料的蜡块，以备切片。

二、 实验用品

（一）器材

恒温箱，温台，熔蜡炉，蜡杯，纸盒，酒精灯，镊子，解剖针，面盆。

（二）试剂

无水酒精，二甲苯，石蜡。

（三）材料

已脱水的动物材料。

三、 实验程序

（一）透明

1. 透明的方法

透明过程也是渐次由低浓度到高浓度。脱水的材料一般先在纯酒精和透明剂各半的混合液中浸渍1～2h，然后再转入纯透明剂中透明。透明浸渍的时间可视材料情况而定，一般30min到2h。在纯二甲苯中应更换二次，总的停留时间以不超过3h为宜。

2. 透明注意事项

（1） 使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。

（2） 更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能

避免吸收湿气。

（3） 在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，

应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。

（二）透蜡

1. 透蜡的方法

石蜡透入动物组织的方法是：材料自透明剂中取出后先移入透明剂和石蜡等量的混合液（蜡杯Ⅰ）约15～30min，然后进入纯石蜡中（蜡杯Ⅱ），换新鲜石

蜡（蜡杯Ⅲ）一次。总的石蜡透入时间约1～1.5h；如组织块小（约2mm×3mm×3mm），通过3个杯子的时间合计30min已足够；组织块大约（3mm×3mm×10mm）的，不仅每次转换的时间要延长，还需要多加一只杯子，共需2h左右。

2. 透蜡注意事项

（1） 尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；

（2） 透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；

（3） 操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、

变脆、收缩等。

（三）包埋

1. 包埋的工具

（1） 温台：为了避免在包埋时石蜡立即凝固，包埋要在温台中进行。

（2） 酒精灯：放在温台下加温用。

（3） 恒温箱：透蜡和包埋都要在恒温箱中进行。

（4） 纸盒：作为包埋用的容器。

（5） 镊子：要放在恒温箱中预热，否则当移取材料时，镊子尖端的石蜡容易凝

固。

（6） 面盆或水槽：内放入冷水作冷却石蜡之用。

2. 包埋的操作过程

包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从恒温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯Ⅲ，迅速轻轻地用温镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在面盆或水槽中的水面上，待纸盒内石蜡的表面凝固，即可将纸盒向一侧倾斜，使冷水从一边浸入纸盒，并立即使它沉入水中，使盒中包埋块迅速凝固。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。

石蜡切片法（三）

------切片、贴片

一、 实验原理

切片就是把包埋好的材料块用切片机切成所需要的厚度的切片带。

贴片是用粘贴剂把切片平铺贴在载玻片上，以便于染色。

二、 实验用品

（一）器材

切片机，切片刀，磨刀机或磨刀石，单面刀片，展片台，酒精灯，温度计，蜡铲，台木，毛笔，蜡带盘，载玻片，镊子。

（二）试剂

粘片剂，氯仿。

（三）材料

以包埋好的蜡块。

三、 实验程序

（一）切片

1. 切片前的准备工作

包埋好的石蜡块装在切片机上进行切片前还须做以下的准备工作。

（1） 石蜡快的固着：石蜡块要进行切片前，要先把它固着在台木上，然后装在

切片机的夹持部分进行切片。石蜡块的固着方法如下：

先将蜡块用单面刀片切成方形或长方形，然后四周留下2～3mm宽的石蜡。点燃酒精灯，然后用考热的蜡铲放在台木和蜡块之间，利用蜡铲的温度熔化两者的蜡，抽出蜡铲，在蜡块上略加压力，蜡块就粘附在台木上。

（2） 整修：石蜡块固着后稍放片刻，让它完全凝固后就可以进行修快。修快就

是用单面刀片将蜡块四周修整平行。如果上下两面不平行的话，则切出的蜡带会弯曲。其次，如果组织的上下、左右的蜡留得太多，那么每一切片所占的位置大，在一张载玻片上只能贴几个切片，既不经济，镜检时也不方便。

（3） 磨刀：切片刀锋利与否对切片的质量有很大的关系，若切片刀迟钝或有了

缺口以后将会引起切片的断裂、破碎、不完整或厚度不匀及皱折等现象。所以切片前一定要先把刀磨好。

切片刀的刃磨一般有两种：一种是机磨，另一种为手工磨。

2. 切片机

切片机的式样很多，性能也不一样，多数切片机除进行石蜡切片外，还可安装冷冻装置进行冷冻切片。一般常用的切片机为轮转式切片机。

3. 切片的方法

现将轮转式切片机切片的方法简述如下：

（1） 将以固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。

（2） 将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。

（3） 摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。

（4） 调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15°左

右。

（5） 调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般4～10µm。

（6） 一切调整好后就可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，

左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40～50r/min为宜。

（7） 切成的蜡带到20～30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，

以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。

（8） 用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻片上加水一滴，置于放大镜或

显微镜下观察切片是否良好。

（9） 切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切

片机擦拭干净妥为保存。

（二）贴片

1. 取一片清洁的载玻片，滴一滴粘片剂于玻璃中央，然后用洗净的手指加以涂抹，便成均匀薄层。

2. 滴1～2滴的蒸馏水于已涂粘片剂的载玻片上。

3. 用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上，注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。

4. 把玻片置于预先加热的展片台上（温度保持在40～45℃）。此时蜡片因受

热而伸展摊平。

5. 展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于37℃的温箱烘干，一昼夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。

石蜡切片法（四）

------染色、封藏

染色是生物制片中最重要的环节之一，只有通过染色，细胞和组织才显得更清楚，微小的细胞结构才得以分辨。

一、 实验原理

1. 染色的一般原理

细胞和组织的不同结构之所以能被染成各种不同颜色，是由于染料对它们所起的物理或化学的综合作用。

（1）物理作用

① 渗透作用：染料渗透到多孔的组织中，与组织没有牢固的结合。

② 吸收作用：组织吸收染料中的色素粒子，与之牢固结合，组织着色与燃料的颜色相同，不一定与干燥燃料的颜色相同，如品红在干燥状态时为绿色，而其溶液呈红色。组织在染色后也呈红色，即使组织干燥后，其红颜色仍不变。

③ 吸附作用：染液中分散的色素粒子进入被染物质的粒子间隙内，由于分子的引力作用，色素粒子被吸附而染色。也由于各种蛋白质或胶体有不同的吸附面，因此可以吸附不同的离子。也就是说对离子的吸附有选择性，即有的容易被某些物质吸附，有的则不容易吸附。

（2）化学作用：生物细胞内含有酸性和碱性物质，分别可与燃料中的阳离子和阴离子互相结合，这种反应使组织细胞染上颜色。例如,细胞核含酸性物质，易与碱性染料苏木精结合，细胞核被染上颜色。细胞质含碱性物质，易与酸性染料伊红中有染色作用的阴离子结合，细胞质为伊红所染。但是，嗜碱性和嗜酸性只是相对的，若标本在碱性染料液内留置过久，细胞质也可着上碱性燃料的颜色。

上述这两个主要的染色理论，若单独用一种学说来解释所有的染色现象都是有困难的。染色的机制是很复杂的，目前了解得不很清楚。目前比较明确地认为，染色主要是由于物理作用与化学作用综合发生作用的结果。

2. 封藏的原理

封藏是使已经透明的材料，保存在适合折光率的封藏剂中（如封藏剂加拿大树胶的折光率为1.52，它与玻璃的折光率1.51很接近），使材料能在显微镜下清晰的显示出来，并能长期保存。

脂肪和类脂（磷脂、糖脂、固醇脂等）统称为脂类。它是构成人体组织的正常成分，不溶于水而易溶于酒精、乙醚、氯仿等脂溶剂中。在化学组成上，脂类属于脂肪酸的酯或与这些酯有关的物质。脂类的主要功能是氧化供能。脂肪主要存积于脂肪组织中，并以油滴状的微粒存在脂肪细胞浆内。

在病理检验中，脂类染色法最常用以证明脂肪变性，脂肪栓子以及肿瘤的鉴别。脂类染色使用最广泛的染料是苏丹染料，最常用的有苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ，苏丹黑及油红O 等。脂肪被染色，实际上是苏丹染料被脂肪溶解吸附而呈现染料的颜色。经研究认为组织中脂质在液态或半液态时，对苏丹染料着色效果

最好。根据这一原理，适当提高温度（37℃-60℃）对组织切片染色效果是有好处的。脂类染色，用冰冻或石蜡切片，以水溶性封固剂封固，如甘油明胶和阿拉伯糖胶等。

二、 实验用品

（一）器材

染色缸，酒精灯，树胶瓶，镊子，盖玻片，显微镜。

（二）试剂

70％酒精。染色液0.5％苏木精，苏丹Ⅲ，甘油明胶，蒸馏水。

（三）材料

已切好的石蜡切片。

三、 实验程序

苏丹Ⅲ(Sudan Ⅲ)染色法：

操作方法：

（1） 经蒸馏水后，浸染于Harris 苏木素 或明矾苏木素中淡染5 分钟。

（2） 自来水冲洗10分钟。

（3） 水洗后，移入70%酒精20 秒钟。

（4） 投入苏丹Ⅲ染液中约50 分钟，置于56℃温箱中。

（5） 在70%酒精中洗涤20 秒钟。

（6） 洗于蒸馏水中3分钟。

（7）将切片周围的水分小心擦掉。

（8） 甘油明胶封固。

结果：脂肪呈橙红色或鲜红色或黑色，胆脂素呈淡红色，脂肪酸不着色，细胞核呈蓝色。

试剂配制：

1. 苏丹Ⅲ染液配法：将0.15 克苏丹Ⅲ溶解于100ml70%酒精或纯丙酮和70%酒精

混合液中（各50ml），临用时过滤，所得滤液即为饱和浓度。

注：浸染时，容器必须盖好，否则酒精或丙酮挥发，染料沉淀。

2.甘油明胶配制：

明胶 40g

蒸馏水 210ml

甘油 250ml

石碳酸结晶 5ml

先将明胶浸入蒸馏水中2 小时或更长时间，然后加甘油和石碳酸，加热15 分钟，摇搅直至混合液均匀为止。

2.封藏的方法

封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。材料透明后，按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴甘油明胶（千万不能等二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接触，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻璃棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后，，用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。