9-高效液相色谱法2
9.1 概述
9.2 高效液相色谱仪
9.3 流动相和固定相简介
9.4 9.4.1 液固吸附色谱法9.4.2 液液分配色谱法9.4.3 离子对色谱法9.4.4 离子交换色谱法
9.4.5 离子色谱法
9.4.6 空间排阻色谱法
9.4.7 亲和色谱法
9.4.8
色谱分离方法的选择
9.5.2 定量分析
9.5.3
应用9.5 9.5.1 定性分析
2013-06-191
9.4 高效液相色谱方法各论
按分离机制,可将HPLC分为:
p液固吸附色谱法
liquid-solid adsorption chromatography,LSAC
p液液分配色谱法
liquid-liquid partition chromatography,LLPC
p离子对色谱法
ion-pair chromatography,IPC
p离子交换色谱法
ion-exchange chromatography,IEC
p离子色谱法
ion chromatography,IC
p空间排阻色谱法
stericexclusion chromatography,SEC
p亲和色谱法
affinity chromatography,AC
9.4.1 液固吸附色谱法分离原理:组分在固定相吸附剂上的吸附作用不同。
吸附
解吸
ØK值越大,保留时间越长。
Ø极性较小组分吸附力较弱,容易解吸,先流出;极性较大组分滞留作用大,后流出。饱和烃
缺点:重复性差,色谱柱再生的时间长,耗费溶剂多。
固定相:种类:硅胶——中性、酸性化合物
氧化铝——碱性化合物,稠环芳烃
氧化锆及其复合氧化物——碱性化合物
结构类型:全多孔型和薄壳型
粒度:5~10μm
流动相:Ø选择最佳的溶剂强度
使流出峰的容量因子控制在1~10的范围内;
Ø选择适当的溶剂组成
为了改进分离的选择性可改变溶剂的组成;
Ø控制溶剂的含水量
对固定相的含水量必须严格控制。2013-06-194
硅胶表面结构
例,液固吸附色谱法分离番茄红素异构体
trans
9-
cis5-cis
13-cis
色谱柱:Nucleosil300-5 (Macherey-Nagel);柱温:25 ℃
流动相:正己烷
检测器:DAD;检测波长:475 nm
流速:1mL/ min
9.4.2 液液分配色谱法
分离原理:组分在固定相和流动相上的分配作用
不同。
Cs、Cm是溶质在固定相和流动相中的浓度
Vm、Vs为流动相和固定相的体积
K为分配系数;k为容量因子
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流动相:
为防止固定液流失,流动相与固定液应尽量不互溶,或者说二者的极性相差越大越好。
反相色谱中,随流动相极性增加,组分分配比k增加?
正相色谱
低极性流动相反相色谱高极性流动相
时间
中等极性流动相时间中等极性流动相
时间时间
待测物极性:A>B>C
正、反相色谱中极性和保留时间的关系
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固定相:
化学键合固定相:将各种不同功能分子通过化学反应键合到担体表面的游离羟基上。u极性键合固定相
键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子,用于正相色谱。
u非极性键合固定相
键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子,用于反相色谱。
Ø最常用的是ODS(OctaDecyltrichloroSilane)柱或C18柱。
根据硅胶表面的化学反应不同:
a. 硅氧碳键型:≡Si—O—C
b. 硅氧硅碳键型:≡Si—O—Si —Cc. 硅碳键型:≡Si—Cd. 硅氮键型:≡Si—N
稳定,耐水、耐光、耐有机溶剂,应用最广
。
硅胶十八烷基氯硅烷
ODS(C18)键合相
物理性
质化学性
质
化学键合固定相的特点:
优点:
传质快:表面无深凹陷,比一般液体固定相传质快;寿命长:化学键合,无固定液流失,耐流动相冲击;选择性好:可键合不同官能团,提高选择性;有利于梯度洗脱。缺点:
不适用于酸碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。
固定相:C1固定相:C8固定相:C18
时间,min
硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响
1-尿嘧啶;2-苯酚;3-乙酰苯;4-硝基苯;5-苯甲酸甲酯;6-甲苯
反相键合色谱中,键合相碳链越长,分离效果越好!
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14
例:NPLC-ELSD法分析水产品中的磷脂含量
CL 心磷脂;PE 脑磷脂;PI 磷脂酰肌醇;PS 磷脂酰丝氨酸;PC 卵磷脂;SM 鞘磷脂;LPC 溶
血卵磷脂
色谱柱:ZorbaxRx-SIL(250mm×4.6mm, 5μm)
流动相A:氯仿:甲醇:氨水;流动相B:氯仿:甲醇:水:氨水检测器:ELSD
RPLC法分析不同来源样品中虾青素的存在形式
双酯
单酯
游离
固定相:C30 流动相:甲醇-甲基叔丁基醚
柱温30℃流速1.0ml/min 紫外检测波长
476nm
9.4.3 离子对色谱法
分离原理:将一种或多种与溶质离子电荷相反的离子(对离子或反离子)加到流动相或固定相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物,增加溶质与非极性固定相的作用,使k增加,改善分离效果。
容量因子k随KXY和[Y-]水相的增大而增大。
对离子的选择:
Ø分析阴离子:常采用烷基铵类,如氢氧化四丁基铵、氢氧
化十六烷基三甲铵、三乙胺等;
Ø分析阳离子:常采用烷基磺酸类,C4~C8的烷基磺酸
盐,如己烷磺酸钠。应用:适用于强极性的有机酸、有机碱的分离;酸、碱和
离子、非离子难分离的混合物,特别是核酸、核苷、生物碱、药物等质量大的有机离子的分离。思考:有一强极性有机酸混合物,若用离子对色谱法分离,
请问在流动相中应加入阴离子还是阳离子形成离子对?
例:反相离子对-柱后衍生荧光检测水产品中的生物胺测定
色谱仪:Agilent 1100液相,Pickering PCX5200柱后衍生系统色谱柱:日本资生堂CapcellPak MG-C18柱(150mm×4.6mm,
5μm)
流动相流速:1.0mL/min;进样量:20μL梯度洗脱条件:
时间(min)[1**********]
流动相A流动相B
8020
5050
4060
2080
4060
8020
离子对试剂:辛烷磺酸钠
衍生剂:邻苯二甲醛(OPA)
荧光检测器条件:激发波长λEX=330nm,发射波长λEM=465nm;衍生剂流速:0.3mL/min
柱温:40℃;衍生反应池温度:45℃
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标准谱图(5.0 mg/L
)
组胺Histamine;酪胺Tyramine;尸胺Cadaverine;精胺Spermine;亚精胺Spermidine;腐胺Putrescine;腓精胺Agmatine;内标1,6-Diaminohexane
鱿鱼
牡蛎
对虾
9.4.4
离子交换色谱法
分离原理:离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具
有相同电荷的溶质离子进行可逆交换反应。
++++--阳离子交换:R-SO3H+M⇔R−SO3M+H
阴离子交换:R-NROH+X⇔R−NRX+OH
+3
−
−
+3
−
−
KEX
[XR]s[Y]m=
[YR]s[X]m[XR]S[YR]S
K==KEX
[X]m[Y]m
KEX愈大,表示溶质离子X与固定相亲和力愈强,保留值愈高。
•对阳离子,滞留顺序为:Fe3+ >Ba2+ >Pb2+ >Sr2+ >Ca2+ >Ni2+ > Cd2+ >Cu2+ >Co2+ >Zn2+ >Mg2+ >UO22+ >Tl+ >Ag+ >Cs+ >Rb+ >K+ > NH4+ >Na+ >H+ >Li+
•对阴离子,滞留顺序为:柠檬酸根>SO42->C2O42->I->HSO4->NO3->CrO42->Br->SCN->Cl->HCOO-> CH3COO->OH->F-思考:待测阳离子电荷越小、其水合离子的半径越大,则
越先出峰?应用:离子及可离解的化合物,氨基酸、核酸等。
固定相:
p按离子交换剂类型分为四种:
p按固定相制作方法可分为:
多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型);表面多孔型(包括薄膜型)离子交换树脂;
离子交换键合型:薄壳键合型;微粒硅胶键合型。
微孔型大孔型
薄膜型
表面多孔型
离子交换色谱流动相的选择:
upH:增加pH样品的正电性降低,在阳离子交换色谱上组分的保留值降低;在阴离子交换色谱上组分的保留值增加。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。u离子强度:对保留值的影响比pH更大。流动相的离子强度越大,则洗脱能力越强。u缓冲液类型:不同离子具有不同的离子电荷、离子半径及离子的溶剂化特性,它们与离子交换基团的作用力也不同,因此有不同的洗脱能力。u有机溶剂:外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小,保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。
例:HPLC-SAX法分析制备氧化降解后的寡糖混合物
……..
H2O2
n
CuO3
O3
+
k
O3
l
-
O3
3-
O33
3自由基降解美国肉参硫酸软骨素的机理
9.4.5 离子色谱法
传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题:Ø需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长;
Ø洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。分离原理:离子交换原理
例如:分析阳离子时,以无机酸为流动相,抑制柱为高容
量的强碱性阴离子交换树脂,则发生下列反应:
R+—OH + HCl(流动相)——R+—Cl-+ H2OR+—OH + MCl(待测物)——R+—Cl-+ M+OH-可见,不仅大量酸转化为低电导的水,而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。
p不足之处:抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽,降低分离度。因此,现已发展为自动连续再生型抑制器
。
思考:IC分离中,何为抑制柱?
分析阴离子时,抑制柱中应填充何种离子交换树脂?
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离子色谱的基本流程图
DIONEX ICS2000
F-
Cl-NO2-
Br-
NO3-SO42-HPO4
2-
检测
器
泵液
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进样分离检测记录
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离子色谱常用的流动相:
p阴离子分析:氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠、硼砂、氢氧化钠等;
p阳离子分析:甲烷磺酸、酒石酸、柠檬酸、草酸等。特点:
Ø分析速度快:可在数分钟内完成一个试样的分析;
Ø分离能力高:在适宜的条件下,可使常见的各种阴离子混合物分离。例在十几分钟内,可使7种阴离子完全分离。应用:适用于微量离子或可离解化合物的分析。注意:耐腐蚀,仪器流路采用全塑件。
F-
K+
-NO2--
Na+
NO3-SO42-42-
NH4+
Mg2+
Ca2+
例,IC法检测添加的三聚磷酸盐在新鲜碎鳙肉中发生的水解
a. 未加, b. 10min, c. 30min, d. 270min, e. 600min
Ø鳙肌原纤维蛋白具有三聚磷酸盐水解酶活性,能将TPP水解成PPi和Pi。
9.4.6 空间排阻色谱法
分离原理:基于不同分子大小的组分在多孔性物质(凝胶)
固定相中具有不同的渗透能力。
K=
Ve−VO
S
=CS
M
K为溶质的分配系数。Ve —溶质洗脱体积,Vo —凝胶颗粒间体积,Vs —孔穴中溶剂体积。
n凝胶过滤色谱——流动相为水或缓冲液,分离水溶性高分子n凝胶渗透色谱——流动相为有机溶剂,分离脂溶性高分子应用:用于分离不同相对分子质量范围的组分。特别适用于
生物样品和高分子化合物
分析。
固定相:
材料 葡萄糖凝胶 软性凝胶
聚苯乙烯
半刚性凝胶 聚苯乙烯
聚乙酸酯 玻璃珠 刚性凝胶
多孔硅胶
类型
型号 Sephadax Bio-head-S Styragel Emgel(OR) CPG-10 Porasil 特点 溶胀,小分子分离 溶胀较小流速较小 刚性大、高流速分离
流动相 水
有机溶剂 有机溶剂 有机溶剂
有机溶剂和水 有机溶剂和水
流动相的要求:能溶解样品且与凝胶相似(润湿凝胶)、
粘度小(增加扩散速度)。
常用流动相:
Ø分离高分子有机化合物:四氢呋喃、甲苯、间甲苯酚等;Ø分离生物物质:水、缓冲盐溶液、乙醇、丙酮等。
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空间排阻色谱法的特点:
分离机理与其它色谱法不同组分峰全部在死体积前出峰;流动相的作用不是为了控制分离,而是为了溶解样品和润湿凝胶的;
可对相对分子质量在100~8×105范围内的化合物按质量分离。
不能分离大小相似、相对分子质量差别小于10%的分子。
例,排阻色谱法测定海参粗多糖的分子量分布
海地瓜
粗多糖SC-CHSSC-FUC
115.7kDa
127.8kDa
102.5kDa
118.2kDa
白乳参蝶参黑狗
参
1614.1kDa833.2kDa263.4kDa600.2kDa
色谱柱:TSK-gel G4000PWxl (300mm×7.8mm)流动相:0.2mol/L NaCl检测器:RID
9.4.7 亲和色谱法
分离原理:于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨(称为间隔臂),然后再连接上配基,如酶、抗原或激素。当含有复杂混合试样的流动相流经这种经固定化的配基时,其中具有亲合力特性的生物大分子与配基相互作用而被保留,无此作用的则被洗出;随后,改变流动相pH或组成,再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。特点:选择性过滤、纯化效果好。应用:主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲和力进行选择性分离及纯化的方法。
2013-06-19
亲和色谱固定相结构:
氨丙基硅胶
丁二酸
胞嘧啶核苷酸(CMP)
例,亲和色谱法分离分析寡聚腺苷酸十二至十八聚体
固定相:胸腺密度脱氧核苷酸十八聚体键合硅胶色谱柱(300mm×4.6mm)流动相:NaCl+Na3PO4(pH 6.5)程序升温:8 ℃至44 ℃
9.4.8 液相色谱分离方法的选择
n正确选择色谱类型:
尽可能多的了解样品性质
Ø
Ø
Ø
Ø化学结构极性和稳定程度水中和有机溶剂中溶解度相对分子质量的大小
熟悉各种色谱类型主要特点和应用范围
极性增加
不溶于水溶于水
2013-06-19非极性离子非离子极性分配吸附反相分配正相分配离子交换分子量空间排阻凝胶渗透凝胶过滤各种HPLC方法的应用范围及对象42
液相色谱分离类型选择参考表
溶于水——排阻色谱,水为流动相
相对分子质量
>不溶于水——排阻色谱,非水流动相
同系物——分配色谱
不溶于水
样品
相对分子质量异构体——吸附色谱分子大小差异——排阻色谱反相液-液色谱溶于水,不离解
<排阻色谱,水为流动相
碱——阳离子交换色谱
溶于水,可离解
酸——阴离子交换色谱
溶于水,离子与非离子—反相离子对色谱
n按固定相与流动相相对极性的不同,液液分配色谱可分为哪两类?现在有A、B两物质,极性A>B,问在两种液液分配色谱上的出峰顺序如何?
n分离下述化合物,宜选用何种色谱方法?
(A)聚苯乙烯相对分子量分布(B)多环芳烃
(C)氨基酸(D)Ca2+,Ba2+,Mg2+
9.5 高效液相色谱的分析和应用
9.5.1 定性分析
(1)标准样品法
(2)谱库
HPLC-FTIR
HPLC-MS
9.5.2 定量分析
峰面积正比于浓度或质量
2013-06-1945
9.5.3 应用
本章重点:
1. 检测器的原理及特性
UVD (VWD,DAD);FLD;RID;
ELSD;ECD (CD,AD)
2. 各种高效液相色谱方法的固定相和流动相、特点和应用液固吸附色谱法;液液分配色谱法;离子对色谱法;离子交换色谱法;离子色谱法;空间排阻色谱法;亲和色谱法。