间皮细胞在腹膜抗菌防御中的作用

间皮细胞在腹膜抗菌防御中的作用2011-09-15 臧燕　张薇　张训　侯凡凡 　　【摘要】　目的　探讨间皮细胞在腹膜抗菌防御中的作用。方法　采用体外细胞培养模型，以间接免疫荧光技术和细胞瑞氏染色方法，观察了细菌脂多糖(LPS)、金葡菌肠毒素和白细胞介素-1(IL-1)诱导大鼠腹膜间皮细胞粘附分子-1(ICAM-1)的表达，及其对金葡菌粘附和单核细胞表面吞噬作用的影响。结果　腹膜间皮细胞表达ICAM-1粘附分子，用LPS、金葡菌肠毒素和IL-1刺激培养6小时可增加间皮细胞ICAM-1的表达，同时可增加细菌对间皮细胞的粘附率。单核细胞对粘附间皮细胞表面的调理与未调理细菌均能很好地吞噬，两者吞噬率比较无明显差异(P＞0.05)。结论　炎症介质和炎性细胞因子通过刺激间皮细胞ICAM-1的表达增加，增强间皮细胞对细菌的粘附，为单核细胞吞噬粘附其表面的细菌提供一个适宜的环境。 　　【关键词】　巨噬细胞，腹膜　　吞噬作用　　胞间粘附分子-1 The role of mesothelial cells in peritoneal antibacterial defence　　Zang Yan, Zhang Wei, Zhang Xun, et al. Department of Nephrology, Nanfang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou 510515 　　【Abstract】　Objective　To study the role of the mesothelial cells (MCs)in peritoneal antibacterial defence. Methods　The MCs from rat omentum were seperated and cultured in vitro. The expression of the adhesion molecule on the surface of MCs incubated in RPMI-1640 medium alone and stimulated by IL-1, LPS or intestinal toxin was assessed. The effects of IL-1, LPS or intestinal toxin on the rate of S.aureus Cowan I adherence to MCs monolayers as well as the rate of phagocytosis of S.aureus by monocytes were observed. Results　MCs incubated in RPMI-1640 medium alone released trace ICAM-1 as measured by indirect immunofluorescence. The ICAM-1 level was significantly increased when MCs was stimulated by IL-1, LPS or intestinal toxin for six hours, so was the adherence rate of S.aureus to MCs monolayers. Adherence of S.aureus to mesothelial monolayers increased significantly when the becteria were opsonised with pooled human serum, but the phygocytosis by monocytes occurred indepandently. Conclusion　The MCs express high level of ICAM-1 and increase the adherence of bacteria in early peritoneal inflammation so as to provide a favourable surface for the elimination of bacteria invading peritoneal cavity. 　　【Key words】　Macrophages, peritoneal　　Phagocytosis　　Intercellular adhesion molecule-1 　　细菌性腹膜炎是腹膜透析过程中常见的并发症。细菌侵入腹腔后主要由腹腔中的巨噬细胞将其吞噬、杀灭，净化腹腔，从而维持腹膜的正常结构和功能。但近年研究报道，接受腹膜透析的患者腹腔巨噬细胞吞噬功能明显降低［1］，而

腹膜间皮细胞却显示出某些潜在的功能，如通过分泌白细胞介素-1(IL-1)和前列腺素等促炎症介质［2，3］，参与腹膜抗感染过程。目前，对间皮细胞在腹膜炎症中 的抗菌防御作用仍知之甚少，特别是腹膜炎初发期，当循环中的调理素尚未到达腹腔，而细菌却大量繁殖，间皮细胞作为首先与细菌接触的表面，是被动受害还是主动参与腹膜抗感染过程，目前尚未见报道。为此，本实验模拟腹腔细菌感染内环境，研究细菌毒素和IL-1诱导体外培养的腹膜间皮细胞粘附分子的表达，及其对细菌粘附和腹腔吞噬细胞表面吞噬作用的影响，以探讨间皮细胞在腹膜抗菌防御中的作用。 材料和方法 　　1.大鼠腹膜间皮细胞的分离、培养和鉴定：按照本室先前建立的人腹膜间皮细胞分离、培养方法［2］，稍加改良。即：无菌取5只SD大鼠小网膜和肠系膜，分别用Hank液洗数次，剪碎，用胰蛋白酶/EDTA消化15分钟，37℃不断震摇，终止消化后1 000 r/min，离心10分钟，弃上清，用含5 mg/L转铁蛋白、1 mg/L氢化可的松、2 mmol/L的L-谷胺酰氨和10% FCS的完全RPMI-1640培养液重悬细胞，调整细胞数为1×105/ml浓度，接种在包被明胶的培养瓶中，37℃、5% CO2培养箱中培养。传代细胞经形态学和超微结构鉴定具有间皮细胞特征。免疫组化示抗细胞角蛋白、抗波形蛋白(vimentin)抗体(购自DAKO公司)染色阳性，抗第Ⅷ因子相关抗原(购自DAKO公司)和抗白细胞CD45抗原的抗体(购自军事医学科学院)染色阴性。 　　2.间皮细胞表面粘附分子的诱生及检测：取第三代间皮细胞以1×106/ml浓度接种于改良的Petri培养皿中，置37℃、5% CO2培养箱中过夜。设四个组，两个皿为一组，次日于每组培养上清中加入LPS(Sigma产品)、金葡菌肠毒素(本校微生物教研室惠赠)或IL-1(购自军事医学科学院)刺激培养，第四组是对照组，为10% FCS的RPMI-1640培养(不加任何刺激因素)；另设一个阴性参照皿(用IL-1刺激，但不染“一抗”)。刺激剂量LPS和金葡菌肠毒素组终浓度均为5 mg/L、IL-1组为5 U/ml，刺激培养时间为6小时。培养结束后，用PBS洗培养皿3次，弃净液体后加1%多聚甲醛固定细胞5分钟，再用PBS洗3次，吸干皿孔内液体，于每组的第一个Petri培养皿内加入100 μl抗ICAM-1抗体(CD54单克隆抗体，美国NeoMarkers公司产品)，第二个Petri培养皿内加入100 μl抗血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)抗体(CD106单克隆抗体，法国Immunotech公司产品)，阴性参照皿加含1% BSA的PBS，室温放置45分钟，然后用PBS洗掉未结合的“一抗”，同法于每皿孔内加入100 μl适当稀释的羊抗鼠荧光抗体(法国Immunotech公司产品)，室温避光放置30分钟，用PBS洗净未结合的“二抗”。样本经上述步

骤标记好后，在粘附式细胞仪(ACAS 570型，美国)进行荧光强度测定。选择紫外波长为488 nm，每例样本测定100个以上细胞，以平均荧光值(AV)为定量参数。 　　3.细菌及其调理过程：取金黄色葡萄球菌(本校微生物教研室提供)接种在不含抗菌素和含5%混合人血清的RPMI-1640培养液中，37℃水浴摇床，150 r/min，60分钟，然后4℃、1 000 r/min，离心30分钟，被调理的细菌重悬在RPMI-1640培养液中，配成1×108/ml浓度菌液，4℃保存备用。未被调理的细菌以同样方式在无血清液体中进行。