苯甲酸免疫胶体金快速检测试纸条的研制_曾文亮

DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.16.069

ScienceandTechnologyofFoodIndustry

分析检

测

苯甲酸免疫胶体金快速检测

试纸条的研制

曾文亮，杨金易*，王

弘*，沈玉栋，罗

林，曾道平，徐振林，孙远明

（广东省食品质量安全重点实验室，农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室，

华南农业大学食品学院，广东广州510642）

摘

要：应用胶体金免疫层析技术，制备苯甲酸胶体金免疫层析快速检测试纸条，采用柠檬酸三钠还原法制备颗粒直

径为17nm的胶体金，将苯甲酸金标抗体喷涂在玻璃纤维垫上制成胶体金结合垫，将包被抗原和二抗羊抗兔分别结合

于硝酸纤维膜作为检测线（T线）和质控线（C线），组装成胶体金免疫层析试纸条并进行灵敏度测试。结果显示，胶体金试纸条检测限为100μg/L，可在5~7min内完成测试，与苯酚、甲苯、苯乙酸、苯丙氨酸等药物均无交叉反应，检测结果与酶联免疫吸附法完全一致。该方法具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高等特点，适用于现场快速检测和筛选工作，具有广泛的商业开发应用前景。关键词：苯甲酸，胶体金，试纸条，快速检测

Developmentofcolloidalgoldimmunochromatographicteststrip

ofcarboxybenzene

ZENGWen-liang，YANGJin-yi*，WANGHong*，SHENYu-dong，LUOLin，ZENGDao-ping，

XUZhen-lin，SUNYuan-ming

（GuangdongProvincialKeyLaboratoryofFoodQualityandSafety，LaboratoryofQualityandSafetyRiskAssessmentin

CollegeofFoodScience，SouthChinaAgricultureUniversity，AgriculturalProductsPreservationMinistryofAgriculture，

Guangzhou510642，China）Abstract：Colloidalgoldimmunechromatographytechnologywasappliedinthisstudy，thecolloidalgold

immunochromatographicteststripwasdevelopedinordertoestablisharapiddetectionassayofbenzoicacid.Thecolloidalgoldwithparticlediameter17nmwasobtainedbyreducinggoldchloridewithsodiumcitrate，benzoicacidgold-labeledantibodywasspottedonsomechosenglassfibermadeofcolloidalgoldcombinedpad，andtheantigenofbenzoicacidandGoatantiRabbitIgGwerecoatedonthenitrocellulosemembranetobethetestline（Tline）andthecontrolline（Cline）.Teststripswereconstructedandthedetectionsensitivitywasmeasured.Resultsshowedthatthedetectionlimitofcolloidalgoldimmunochromatographicteststripwas100μg/Landthewholeanalysisprocesscouldbecompletedwithin5~7min．Withphenol，toluene，benzeneaceticacid，phenylalanineandotherdrugshadnocrossreaction：Resultswereincompleteaccordwithenzyme-linkedimmunosorbentmethod.Themethodhadsimpleoperation，fastcharacteristics，strongspecificity，highsensitivity.ThecolloidalgoldimmunochromatographicteststripcouldbewidelyusedforOn-siterapiddetectionandscreeningworkandhadgreatprospectforcommercialdevelopment.Keywords：carboxybenzene；colloidalgold；dipsticks；rapiddetection中图分类号：TS207.3文献标识码：A文章编号：1002-0306（2013）16-0070-05苯甲酸（Carboxybenzene）又名安息香酸，是一种酸性防腐剂，在酸性条件下对多种微生物有抑制作用[1-2]，可用于酱油、醋、果汁、果酱、果酒、汽水、饮料等多种食品的防腐。但过量食用可诱发癌症、哮喘、

荨麻疹及血管性水肿等变态反应，对人体健康造成

不利影响[3]。另有研究表明，苯甲酸钠会与维生素C反应从而生成苯（苯系致癌物质），所以应禁止在含维生素C食品和药剂中使用苯甲酸钠[4-5]。我国食品卫生法中规定：苯甲酸及其钠盐可用于酱油、醋、果酱等多种食品中，其最大使用量为0.2～1g/kg（浓缩果汁最

[6]

大使用量为2g/kg）。美国食品与药品管理局（FDA）公布了苯甲酸最大使用量在0.15~6g/kg；欧盟的进口食品卫生标准规定苯甲酸最大使用量也在0.15~6g/kg之间。紫外分光光度法[7]、气相色谱（GC）法[8]、高效液

收稿日期：2013－03－29*通讯联系人

作者简介：曾文亮（1987-），男，硕士研究生，研究方向：食品科学。基金项目：农业部公益性行业专项（201003008-08）；广东省教育部产

学研项目（2011A090200029）；福建省科技计划重点项目（2012Y0003）。

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分析检

测

相色谱（HPLC）法[9]、液相色谱/气相色谱-质谱联用（HPLC/GC-MS）法[10]、离子色谱（IC）法[11]、毛细管电

）法[12]、电位滴定法[13]、动力学荧光法[14]等都存泳（CE

在检测成本高、操作复杂繁琐、实验周期长等问题，

）是以胶体金颗粒作为跟胶体金免疫层析法（GICA

踪标记物，以显示抗原-抗体反应的一种免疫标记技术。由于该技术具有方便快捷、特异性好、灵敏度稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直高、

观等诸多优点，在多领域得到广泛的应用[15]。而对于苯甲酸免疫层析胶体金试纸条的研究在国内外均较少，本论文采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗苯甲酸多克隆抗体，对苯甲酸胶体金免疫层析试纸条的检测条件作全面系统的优化，旨在研制出符合市场要求的苯甲酸快速检测免疫胶体金试纸条。

Vol.34,No.16,2013

裁成细条备用。由顶部依次粘于PVC板上，

1.2.3胶体金快速检测试纸条的性能测试将苯甲

10、50、100、200、400、酸药物用阴性样品配制成0、

600、800μg/L等标准系列溶液，在室温且较为干燥的环境下，用吸管吸取80μL标准系列溶液于试纸条的加样孔中，观察不同时间段试纸条灵敏度显示结果，并比较同一批次及不同批次的重复实验结果。在空白样品中分别添加浓度为1000μg/L的系列苯甲酸类似物：苯酚、甲苯、苯乙酸、苯丙氨酸、对氨基苯磺酸和苯甲酸钠，3次重复实验，观察不同药物的交叉反应情况。将制作好的试纸条置于铝箔袋中，加入干燥剂密闭包装，分别置于4、37℃和室温条件下，在不同的时间段内取出试纸条进行测试，观察试纸条的显色情况。

1.2.4实际样品检测方法验证将实际样品（汽水、酱油、肉制品各20份）分别用加热法、无水乙醇提取法和纯水超声提取法进行前处理后，分别用ELISA方法与本实验研制的苯甲酸试纸条进行检测，比较两种方法的一致性。

1

1.1

材料与方法

材料与仪器

苯甲酸标准品美国Sigma公司；氯金酸美国Sigma公司；柠檬酸三钠广州市化学试剂厂；牛血清白蛋白BSA美国Sigma公司；硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、吸水纸、PVC背板均为美国Millipore公司产品。

电子分析天平Mettler-Toledo公司；6K-15高速

荷兰FEI分析型透冷冻离心机德国Sartorius公司；

射电子显微镜Tecnai12；UV-160A紫外-可见扫描

仪日本Kyoto公司；HGS510划膜喷金机和HGS201切条机杭州峰航科技有限公司；纯水设备美国Millipore公司。

2

2.1

结果与分析

胶体金质量分析

经透射电镜观察结果显示，所制备的胶体金粒

径均匀，随机测量100个颗粒，统计得胶体金粒径为17nm左右，如图1所示。

1.2实验方法

1.2.1胶体金的制备和标记采用柠檬酸三钠还原

法[16-17]。将100mL0.01%HAuCl4溶液恒温磁力搅拌加热至沸腾，保持煮沸1min，不断搅拌的同时迅速加入2.0mL质量分数为1%柠檬酸三钠溶液，待溶液颜色鲜红的胶体金溶液并不再变化即可，变成澄清透明、

冷却后加入NaN3至其终浓度为0.02%，4℃冰箱保存，做紫外扫描及电镜透射质量鉴定。

通过实验确定最佳标记pH[18]和最佳标记蛋白量[19-20]。取10mL胶体金用0.1mol/L的K2CO3溶液调pH为8.0，边搅拌边缓慢加入最佳标记量苯甲酸多克隆抗体，搅拌反应30min，加入10%BSA溶液封闭15min。在4℃、1200r/min离心20min，取上清液继续在4℃、12000r/min离心30min，弃上清液，用含1%BSA的0.01mol/L磷酸缓冲液重悬至原体积，重复离心两次，最后用含5%BSA的0.01mol/L的磷酸缓冲液（含0.02%NaN3）悬浮沉淀至原体积的1/10，4℃冰箱保存，紫外扫描鉴定抗体标记效果及纯化效果。

1.2.2胶体金快速检测试纸条的优化与拼装通过实验优化确定最佳金标抗体稀释浓度、最佳包被抗原和二抗包被浓度。将胶体金探针灌注到已处理好的玻璃纤维膜上，真空冻干4h后备用。在NC膜（60mm×300mm）上用喷膜机将包被抗原和包被二抗喷成2条线，至37℃真空恒温干燥箱中干燥4h以上。17mm吸水纸、25mmNC膜、6mm玻璃纤维膜、18mm加样纸，

Fig.1

图1胶体金透射电镜图

Colloidgoldtransmissionelectronmicrograph

2.2最佳标记pH的确定

pH是胶体金标记抗体蛋白的一个关键因素。一般认为，pH在比蛋白质等电点（PI）略高0.2~0.5的条件下，二者易形成牢固的复合物。由图2可知，胶体金

0.40.3A520

0.20.10.0

6

7

8

pH

9

10

图2苯甲酸抗体标记最佳pH的优化测定图Fig.2BestoptimizationofpHdeterminationof

benzoicacidantibodymarkedfigure

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标记抗体蛋白在pH为7.5~8.5时光密度值较高，说明胶体金颗粒和抗体蛋白吸附较好，取光密度最高时对应的pH8.0为最佳标记值。

分析检

测

抗体结合物经过多次离心纯化后的扫描图，同样在529nm和285nm处有特征吸收峰，由于通过离心纯化处理除去金标抗体结合物中的游离的未结合抗体等，曲线B中285nm处的吸收峰值明显较未纯化的曲

结果表明苯甲酸抗体成功地结合至胶线C中的要低。

体金颗粒的表面，且纯化结果较为良好。

2.3抗体最佳标记量的确定

由图3可知，当抗体量达到一定的值（1.8μg/mL）

后，吸光度值基本趋于稳定，则表明抗体蛋白与胶体金己达到最佳的结合比例。在此基础上增加20%即

（约1.8μg/mL×（1+为稳定1mL胶体金实际所需抗体量

20%）=2.16μg/mL）。

0.60.4A520

0.20.0

12

抗体量（μg/mL）

3

2.5金标抗体稀释浓度的优化

以苯甲酸多抗为标记抗体，标记量2.16μg/mL，

1.0mL胶体金标记抗体离心纯化后，按不同比例再稀

1/2倍和1倍，制成金垫。以0.5mg/mL的喷释成1/3倍、

膜浓度包被质控线和检测线。用阴性样品和已制备好的苯甲酸标准品进行检测。结果如表1所示，在1/3倍稀释免疫金时，质控线和检测线颜色均较深，苯甲

而当1倍酸标准品浓度为100μg/L时检测线仍可见；

体积稀释免疫金时，阴性样品显色程度都达不到要求；相比之下，将沉淀稀释成1/2倍原体积的免疫金液时，无论从显色程度还是所能达到的检测限，均是最优的选择。

2.6包被抗原的选择及浓度优化

图3苯甲酸抗体最佳加入量分光光度计测定图Fig.3Benzoicacidspectrophotometerdeterminationforthe

amountofantibodybestfigure

分别用两种包被抗原T1和T2以1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL浓度包被检测线和1.0mg/mL二抗

用阴性样品和已制包被质控线，得到10组不同结果。包备好的苯甲酸标准品进行检测。结果如表2所示，

被抗原T1的检测线全部不显色，表明包被抗原T1不能与免疫金结合，可能是由于结合位点被占据而失去结合能力；当质控线包被浓度选择1.0mg/mL，检测线包被抗原T2浓度为0.125mg/mL时，阴性样品两条线显色适中，阳性测试结果可达到100μg/L，综合考虑，比其他浓度组合更优。

2.4金标抗体的制备和纯化

如图4所示，采用紫外扫描对苯甲酸金标抗体结合物的特性及纯化效果进行鉴定。曲线A为标记前胶体金扫描图，其在扫描波段的524nm处有一特征吸收峰；在加入抗体后，最大吸收峰发生了红移现象，吸收峰移到529nm处，同时在图谱约285nm处出现了一个新的抗体蛋白吸收峰，如曲线C所示；曲线B为金标

C

胶体金

纯化后纯化前

2.7二抗包被浓度优化

43OD值

210

200

A

B

分别用以2.0、1.5、1.0、0.5、0.25mg/mL浓度二抗包被质控线和0.125mg/mL包被抗原T2包被检测线，得到5组不同结果。用阴性样品和已制备好的苯甲酸标准品进行检测。结果如表3所示，当二抗包被浓度为1.0mg/mL时，质控线与检测线的颜色最为相近，且颜色适中便于观察，为最佳二抗包被浓度。

2.8

400600

波长（nm）

800

试纸条检测限的确定

图4苯甲酸抗体胶体金标记纯化效果紫外扫描图

Fig.4Benzoicacidantibodycolloidalgoldmarkeduvscan

purificationeffect

注：A：胶体金；B：未纯化的金标抗体结合物；C：纯化后的金标

抗体结合物。

从滴入样品液开始计时，观察不同时间内试纸条的颜色变化。如表4所示，在测试的第3min时试纸条开始出现颜色，5min显色明显，在第7min后显色达到稳定。同一批次及不同批次重复实验，检测限均为100μg/L，故确定本实验的试纸条检测限为100μg/L，整个显色过程在5~7min内达到稳定。

2.9试纸条交叉反应实验结果

由实验结果表5可知，添加浓度均为1000μg/L的

Table1

比较项目1/3倍体积金标抗体液1/2倍体积金标抗体液1倍体积金标抗体液

表1胶体金标记抗体稀释浓度实验结果

Colloidalgoldlabeledantibodydilutionconcentrationexperimentresults阴性样品

10μg/L苯甲酸标准品

++++，+++++，+++，+

50μg/L苯甲酸标准品

++++，++++，+/-++，+/-100μg/L苯甲酸标准品

++++，++++，-++，-

++++，+++++++，+++++，++

注：“，”左右分别表示C线T线显色程度；+表示显色强度；-表示不显色；+/-表示显色隐约可见；表2~表5同。

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测

Table2

比较项目

C=1.0mg/mL，T1=1.0mg/mLC=1.0mg/mL，T1=0.5mg/mLT1=0.25mg/mLC=1.0mg/mL，

C=1.0mg/mL，T1=0.125mg/mLT1=0.0625mg/mLC=1.0mg/mL，

C=1.0mg/mL，T2=1.0mg/mLC=1.0mg/mL，T2=0.5mg/mLT2=0.25mg/mLC=1.0mg/mL，

C=1.0mg/mL，T2=0.125mg/mLC=1.0mg/mL，T2=0.0625mg/mL

Vol.34,No.16,2013

表2包被抗原的选择及浓度优化结果

Envelopeantigenselectionandconcentrationoftheoptimizationresults阴性样品+++，-+++，-+++，-+++，-+++，-+++，+++++++，+++++++，+++++++，++++++，++

10μg/L苯甲酸标准品

+++，-+++，-+++，-+++，-+++，-+++，++++++，++++++，++++++，+++++，+

50μg/L苯甲酸标准品

+++，-+++，-+++，-+++，-+++，-+++，+++++，+++++，+++++，++++，+/-100μg/L苯甲酸标准品

+++，-+++，-+++，-+++，-+++，-+++，++++，+/-+++，-+++，-+++，-

表3二抗包被浓度优化结果

Table3Secondpackageisconcentrationoptimizationresults

比较项目

C=2.0mg/mL，T2=0.125mg/mLC=1.5mg/mL，T2=0.125mg/mLC=1.0mg/mL，T2=0.125mg/mLT2=0.125mg/mLC=0.5mg/mL，

C=0.25mg/mL，T2=0.125mg/mL

阴性样品++++，+++++++，++++++，+++++，++++，+++

10μg/L苯甲酸标准品

++++，++++++，+++++，++++，+++，++

50μg/L苯甲酸标准品

++++，+++++，++++，+++，++，+

100μg/L苯甲酸标准品

++++，-++++，-+++，-++，-+，-

Table4

时间（min）

3578

0+/-，+/-++，+++++，++++++，+++

表4不同时间内观察测试试纸条灵敏度实验结果

Differenttimetoobservetheteststripsensitivityexperimentresults

苯甲酸添加浓度（μg/L）

10+/-，+/-++，+++++，++++++，+++

50+/-，-++，++++，++++++，+++

100+/-，-++，-+++，-+++，-200+/-，-++，-+++，-+++，-400+/-，-++，-+++，-+++，-600+/-，-++，-+++，-+++，-800+/-，-++，-+++，-+++，-

六种结构相似同类物，检测线显色明显，而1000μg/L

的苯甲酸阳性样只有质控线显色，检测线不显色，显示为强阳性，这表明本实验研制的苯甲酸胶体金试

表5交叉反应实验结果

Table5Crossreactionexperimentresults

交叉反应Ⅰ

苯酚甲苯苯乙酸苯甲酸

1000μg/L+++，++++++，++++++，++++++，-交叉反应Ⅱ苯丙氨酸苯磺酸苯甲酸钠苯甲酸

1000μg/L+++，++++++，-++++++，++++++，-

纸条特异性表现良好，与测试的六种类似物没有交

叉反应现象。

2.10试纸条稳定性实验

实验结果见表6。试纸条在室温条件下保存，12个月内质控线和检测线颜色略有下降，但仍显色清晰，背景白色，结合释放垫上金标抗体释放完全，没4℃条件下，在6个有假阳性样品出现，稳定性良好；月内进行三次检测，质控线和检测线在第3个月时出

在现颜色变淡，在第6个月检测时出现了假阳性；

37℃条件下保存，在测试的第2个月试纸条颜色明显变淡，模糊不清，出现假阳性，说明37℃条件下试纸

表6试纸条在不同条件下存放测试结果

Table6Stripstoragetestresultsunderdifferentconditions

苯甲酸浓度（μg/L）

[1**********]

4℃保存时间（月）1++，++++，++++，+++，-++，-3++，++++，+++，+/-++，-++，-6+，++，+/-+，-+，-+，-1+++，++++++，+++++，++++，-++，-室温保存时间（月）

6++，++++，++++，++++，-++，-12++，++++，+++，+++，-++，-1++，++++，+++，+++，-++，-37℃保存时间（月）

2+，++，+/-+，-+，-+，-3+/-，+/-+/-，-+/-，-+/-，-+/-，-

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条加速老化程度明显。最后确定试纸条的保存条件是置于铝箔袋中，加干燥剂室温密闭保存，有效期至少为12个月。

分析检

测

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2.11实际样品检测结果

以ELISA法定量检测为准，由于酶联免疫吸附法

的检测灵敏度高于胶体金方法，所以在浓度为0~100μg/L时胶体金方法将视为阴性样品，所以胶体金法检测的阴性样品是等于酶联免疫吸附法的阴性样品与0~100μg/L的样品之和，从表7可知，检测样品均未出现假阳性和假阴性的情况，两种方法结果完全一致。

表7试纸条和酶联免疫吸附法检测结果

Table7Stripandenzyme-linkedimmunosorbentmethod

detectionresults检测方法ELISA

检测范围阴性0~100μg/L100μg/L以上

试纸条

阴性阳性

汽水（份）酱油（份）肉制品（份）

2513713

578128

497137

3结论

本研究针对苯甲酸药物残留的胶体金免疫层析

试纸条的研制条件作了系统的探讨，建立了用于检测苯甲酸药物残留的方法，方法的检测限为100μg/L，该方法具有快速、简便、特异、安全等特点，整个实验过程可在5~7min完成，结果与酶联免疫吸附法一致，且肉眼即可判断，适用于现场筛选和快速检测工作。

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（上接第69页）

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