三磷酸腺苷二钠片微生物限度检查法验证研究
摘要:建立三磷酸腺苷二钠片的微生物限度检验方法。采用常规法对样品进行方法验证。结果五种规定试验菌的回收率均不低于70%,可用于三磷酸腺苷二钠片的微生物限度检验。
关键词:三磷酸腺苷二钠片;微生物限度检查;方法验证
三磷酸腺苷二钠片是细胞代谢改善药。根据其制剂用药途径,应进行细菌数、霉菌和酵母菌数的测定、及控制菌—大肠埃希菌检查。经实验研究,确定采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌检查。经对所确定的方法进行验证,符合2010年版《中国药典》二部附录?j 有关微生物限度检查法有关规定,方法可行。
1 实验仪器、试药
1.1 实验菌种
枯草芽孢杆菌cmcc (b )63501、金黄色葡萄球菌cmcc (b )26003、大肠埃希菌cmcc (b )44102、白色念珠菌cmcc (f )98001、黑曲霉cmcc (f )98003。
1.2 样品:三磷酸腺苷二钠片:批号: 20101101,20101102,20101103。
1.3 培养基及稀释剂
营养琼脂培养基,玫瑰红钠琼脂培养基,营养肉汤培养基,胆盐乳糖培养基(bl ),改良马丁培养基,mug 培养基,曙红亚甲蓝琼脂培养基, ph7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液,0.9%无菌氯化钠溶液等。
1.4 仪器
培养箱、高压蒸汽灭菌器等。
2 细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法的建立及验证
2.1 菌液制备
取经35℃培养18~24h 的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml 含菌数为50~100cfu 的菌悬液,备用;取经25℃培养24~48h 的白色念珠菌液体培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml 含菌数为50~100cfu 的菌悬液,备用;取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物,加10 ml 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子,吸取菌液用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml 含菌数为50~100cfu 的菌悬液,备用。
2.2 供试液的制备方法
常规法:取样品10g ,用ph7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液制成1:10的供试液;取1:10的供试液1ml 注皿。
2.3 回收率试验
试验组:同2.2,另分别取各试验菌50~100cfu ,分别注入同一平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度,细菌培养24~48h ,白色念珠菌和黑曲霉培养48~72h 。 菌液组:取试验菌50~100cfu 注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度,细菌培养24~48h ,白色念珠菌和黑曲霉培养48~72h ,测定所加入的试验菌数,平行制备2个平皿。
供试品对照组:同2.2,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度,细菌培养24~48h ,霉菌和酵母菌培养48~72h ,测定供试品本底菌数。
2.4 方法的确定
选用金黄色葡萄球菌、白色念珠菌作为敏感菌株进行预试验,结果: 金黄色葡萄球菌回收率为97%,白色念珠菌回收率为93%,表明三磷酸腺苷二钠片对细菌、真菌没有抑制作用,采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数测定可行。稀释剂无抑菌作用,对实验无干扰。
2.5 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证
三批号样品的验证试验结果表明,以常规法进行三磷酸腺苷二钠片细菌数、霉菌及酵母
菌数测定,五种规定试验菌的回收率均大于70%,符合《中国药典》的规定,方法可行。确定三磷酸腺苷二钠片细菌数、霉菌及酵母菌数计数方法为常规法。
3 控制菌检验方法的建立及验证
菌液制备同2.1。
3.1 大肠埃希菌检查方法
常规法:取1:10供试液10ml 接种至100ml 胆盐乳糖培养基,同时加入大肠埃希菌10~100cfu ,35℃培养24~48h 。取培养物0.2ml 接种至含5ml mug培养基的试管中,35℃培养24h 左右,366nm 紫外灯下观察荧光,然后进行靛基质试验,观察结果;另取培养物划线接种于曙红亚甲蓝(emb )平板,35℃培养18~24h ,观察其菌落形态。
3.2 大肠埃希菌试验结果
经胆盐乳糖(bl )培养基培养后,试验组与阴性对照组相比较有明显的变化,试验组有明显产酸产气现象,结果见表2。
4 结语
根据上述实验结果,拟定三磷酸腺苷二钠片微生物限度检查法标准正文如下: 微生物限度 照微生物限度检查法(《中国药典》2010年版二部附录?j )。
取本品10g ,用ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1:10的供试液。
细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌 取1:10的供试液,采用常规法,依法检查,应符合规定。
细菌数每1g 不得过1000cfu ,霉菌和酵母菌数每1g 不得过100cfu ,大肠埃希菌每1g 不得检出。