天然生化药物的研究与开发
天然生化药物的研究与开发
吴梧桐
1
1*
, 王友同, 吴文俊
22
中国药科大学生物制药学院; 2药物生物技术编辑部, 南京210009
摘 要 天然生化药物是来自各种生物体内的天然生化活性成分, 是生物新药研究与开发的重要基础。本文综述了我国生化药物的发展现状和当前国内外研究开发的生化药物的主要品种类型; 同时讨论了天然生化药物研究的几种重要途径, 表明天然生化药物仍为现代生物药物研究与开发的重要领域, 具有广阔的临床应用前景。
关键词 生化药物; 多组分生化药物; 多肽类药物; 蛋白质类药物; 多糖类药物; 蛋白质组学技术 中图分类号 R915 文献标识码 A 文章编号 1672 3651(2004) 02 0070 06
随着生物技术药物的快速发展, 现代生物药物
的概念已有很大扩展, 已形成4大类: 基因重组多肽、蛋白质治疗剂; 基因药物; 天然生物药物; 合成或部分合成的生物药物。到2000年, 在美国已有84种生物新药上市, 最近3年又有64种生物新药通过FD A 批准, 全球的生物药物市场已超过300亿美元, 自2001年以来新批准的新药总数的四分之一是生物新药。这表明生物药物的研究在现代药物研究中居于突出位置。
天然生化药物是来自自然界各种生物体内的生化活性成分, 是生物新药研究开发的基础, 业已证明它是新药研究获得成功的有效捷径。本文综述了我国生化药物的发展现状和当前国内外研究开发的生化药物的主要品种类型, 同时讨论了天然生化药物研究的几种重要途径。1 我国生化药物的发展现状
我国药典收载生化药物50多种, 侧重品种类型为蛋白质激素与酶类药物, 如胰岛素、绒毛膜促性腺激素、生长激素; 尿激酶、天冬酰胺酶、激肽释放酶、凝血酶、胰蛋白酶、细胞色素C 等。1985~1998年我国批准生化药物30多种, 如蚓激酶、胶原酶、天花粉蛋白、FDP 等。近几年又批准了一批生化药物, 如牛肺表面活性剂、尿胰蛋白酶抑制剂、蛇毒凝血酶、胸腺素 藻酸双酯钠、1、神经生长因子、GSH 、降钙素等。
自1995年以来, 我国生物制药产业取得高速
收稿日期 2003 11 06
*通讯作者 吴梧桐:教授, 博导, 中国药学会生物化学专业委员会副主任委员, Tel:025 83271398, E mail:W UWTON G@cpu. edu. cn
[1]
发展。2002年我国生物药品销售额达200亿元,
为1996年的10倍, 生物制药业的盈利由1999年的12亿增长到2002年的25亿元。自2001年以来投资有所回落, 从1999年的7亿元降至2002年的5 96亿元。目前上游转入中游的可应用产品不多, 产品转化率不高, 中下游环节处于 无米下锅 的状况; 中游工程的发展不能满足产业化的要求; 生产规模偏小, 工业不配套, 缺乏产业化必需的工程专业人员, 品种少, 消费能力不足, 导致生产能力相对于产品种类过剩。企业对投资生物制药的高风险估计不足, 资金一次性投入后就难有后续资金跟上, 致使企业发展乏力。
2 当前生化新药研究开发的主要品种类型2 1 多组分生化药物[3]
按国家食品药品监督管理局颁布的药品注册管理办法新规定, 天然生化药物有两大类: 天然物质中提取或通过发酵提取的有效单体及其制剂, 此类生化药物要按化学药品的注册办法审评; 由人、动物的组织或者体液提取的, 或者通过发酵制备的具有生物活性的多组分制品, 此类生化药物要按新生物制品注册办法审评。在日本、欧洲和我国, 有关多组分天然生化药物的研究开发还在不断发展中, 因为这些产品在临床应用中证明是安全有效的, 而且有时也是其它药物所不能替代的。以下简介近年来研究开发成功的几种多组分天然生化药物。
2 1 1 低分子量肝素 由肝素水解, 纯化制备的低分子量肝素制剂(LMW H , 分子量为4000~6000) , 具有吸收好, 半衰期长, 不良反应少等优
点, 因此在冠心病心肌缺血(不稳定型心绞痛、心肌梗死) 、缺血性脑中风、深静脉血栓形成等的治疗中发挥重要作用。临床研究结果表明LMWH 是一种治疗不稳定型心绞痛的安全药物, 具有使用方便、不良反应小等优点。低分子量肝素已收载于英国药典。
2 1 2 脑活素
脑活素最早在欧洲广泛应用, 我国有两种制剂: 以新鲜猪脑制备的蛋白粉进行酶解、纯化制成的制剂, 主要含有16种游离氨基酸(总量达32 44mg/ml) 和低分子多肽(有4种MW
2 1 3 转移因子 转移因子是由具有免疫活性的淋巴细胞释放出的一种物质。它能与抗原结合, 而本身却无抗原性, 能把抗原性及其敏锐的特异性转移给一个免疫反应阴性的受试者, 使受试者产生一种迟发型超敏感反应能力。转移因子有两类: 正常人的转移因子, 指从正常人白细胞, 脾脏、淋巴结及扁桃体组织细胞内提取的HTF (Transferfactor) ; 动物转移因子, 指从牛、羊、猪等动物外周血细胞及其脾脏、淋巴结等组织细胞中提取的TF, 分别称为牛转移因子(B TF) , 羊转移因子(STF) 和猪转移因子(P TF) 。
TF 是多核苷酸、多糖、多肽及其它成分组成的复合分子, 分子量
4
的淋巴细胞、淋巴组织(淋巴结、脾脏等) 能够传递
该动物免疫功能的RNA 。iRNA 具有超越种属界限传递免疫功能的特点, 能够将供者所具有的特异性免疫应答能力传递给受体的机体或淋巴细胞, 这种免疫应答能力的传递既包括体液免疫又包括细胞免疫。iRNA 能够传递免疫球蛋白合成的能力、并能将供者的同种异型标志传给受者。从免疫鼠脾细胞提取的抗肿瘤iRNA 中分离得到三个峰:4~8S RNA 、8~20S RNA 、20~25S RNA 。具有免疫活性的iRNA 位于6~12S RNA, 通过Oligertdr 纤维素层析表明iRNA 中免疫活性成分为mRNA 。iRNA 对RNase 十分敏感, 经RNase 处理, iRNA 丧失免疫活性, 但对DNase 和pronase 不敏感。根据免疫原不同, iRNA 可分为: 抗肿瘤iR NA; 抗感染iRNA 。临床上用抗肿瘤iRNA 治疗肿瘤患者, 能改善症状, 减轻疼痛, 增加体重, 缩小瘤块, 增加免疫功能, 延长寿命, 是肿瘤治疗的有效辅助手段。用抗感染iRNA 治疗乙肝、布氏病、绿脓杆菌感染等均收到良好的效果。
2 1 6 卡介菌多糖核酸 卡介苗(BCG) 是第一个被深入研究的菌体免疫调节剂, 它具有很强的免疫调节功能和有效的抗肿瘤免疫治疗作用。BCG 可以增强细胞和体液免疫功能, 刺激T 细胞增殖, 增强各种抗原的免疫原性, 加速诱导免疫应答, 增强巨噬细胞的各种功能, 但BC G 是一种活菌苗, 抗原性较强, 常引起不良反应。经分离纯化获得卡介苗多糖核酸, 仍具有卡介苗的生物功能, 能明显增强机体的免疫功能和抑制多种肿瘤的生长, 在临床上用于治疗感冒、哮喘和膀胱癌与黑色素瘤的辅助治疗。
2 1 7 胸腺激素(TISE) TISE 主要由多肽和核酸组成, MW 为5000~50000, 其中高活性组分MW 为10000, 对酸、碱、热稳定。TISE 口服药效学证明:可提高环磷酰胺60Co 射线致免疫功能低下小鼠的存活率和小鼠血清溶血素、抗体形成细胞、腹腔巨噬细胞吞噬功能及淋巴细胞转化等免疫学指标。国外还发现TISE 制剂有刺激动物生殖、胚胎发育增重的功能。2 2 多肽类生化药物
2 2 1 多肽疫苗 1999年NI H 公布了两种HIV 病毒多肽疫苗, 已结束 期临床, 因发现HI V 膜蛋白的多肽段有很强的免疫原性, 故将该肽段制成多肽疫苗。还发现丙肝病毒(HCV) 膜蛋白E 2中的
肽段可以刺激机体产生保护性抗体, 可望开发成丙肝多肽疫苗。
2 2 2 抗肿瘤与抗病毒多肽 研究发现一些多肽可以与肿瘤产生的调控因子特异结合, 抑制肿瘤生长, 如抑制腺癌生长的肽, 激活抑癌基因P53的8肽, 可诱导肿瘤细胞凋亡。蜂毒素是一个26肽, 可明显抑制肝癌细胞生长。文蛤多肽, MW 为3354, 是一个33肽, 对多种肿瘤有明显抑制作用。从一株链霉菌中得到一个大分子多肽抗生素有很强的抗肿瘤作用。HCV 非结构蛋白NS3是与病毒复制密切相关的蛋白酶, 一个6肽(DDI VPC) 能显著抑制NS3活性。还有一些小肽能与HIV 的逆转录酶及与HIV 外膜蛋白结合从而阻止病毒进入细胞。
2 2 3 抗菌肽 从昆虫中获得100多种抗菌肽, 有强的杀菌作用, 还有抗癌作用。家蚕抗菌肽D 和蛇毒13肽(INKA IAALAKKLL) , 对G 的G 菌均有极强杀菌作用, 从蚯蚓中分离到两种抗菌肽F 1(MW为535 27) 和F 2(MW 为519 27) 。2 2 4 其它活性多肽 多肽TP508能促进血管再生、加速创伤愈合; 多肽RTR4有抗炎作用; 从脾脏获得的4肽
[4]
+
-
型均有良好防护作用, 对肝细胞的再生有很强的
刺激作用, 并有很强的免疫增强作用, 对四氧嘧啶糖尿病小鼠有防治作用
[5]
。
2 3 6 红细胞原降压因子(EDDF) 从人和猪红细胞纯化的EDDF, 口服注射均有明显降压效果
[6]
。
2 4 酶类生化药物
2 4 1 华广虻纤溶活性蛋白 从华广虻腹部组织分离得到MW 为67000的纤溶性蛋白, 有直接纤溶作用, 能专一水解精氨酸形成的酰胺键(或肽键) 。2 4 2 蚯蚓纤溶酶 从赤子爱胜蚯蚓纯化获得5种纤溶酶, MW 分别为34000、30500、27000、24500和21500、pI 为3 80~4 25, 在pH 6 0~10 0, 50 以下有较高稳定性。从双胸蚓中纯化得到另一种纤溶酶, MW 为32000、pI 3 3, 在pH 5 0~11 0, 55 以下比较稳定。
2 4 3 豆豉纤溶酶 从发酵豆豉中纯化得到一种纤溶酶, 分子量为31000、pI 8 6 2, 比活31020 k/mg。2 4 4 竹叶青蛇毒凝血酶样酶(TSV TEL1) TSV TEL 1由234个氨基酸残基组成, 有一个N 型糖基化位点。
2 4 5 RNA 酶、牛胰腺RNase A 可以抑制肿瘤生长, 注射牛胰RNase 对慢性粒细胞性白血病有改善症状作用; 从豹纹蛙的细胞分布的RNase 、含104个氨基酸, 对皮肤癌有一定疗效, 已进入 期临床, 牛精液RNase 可以选择性地杀伤对化疗药物敏感或具有抗药性的神经母细胞瘤, 而对C D34+造血干细胞生长没有抑制作用[7]。2 5 多糖类生化药物[8]
多糖生物学 (Glycobiology)是生命科学的新前沿, 多糖的结构比蛋白质、核酸更复杂, 其负载的生物信息量比核酸要大几个数量级。由生物材料中已分离和发现了200种以上的多糖, 主要来自细菌、真菌、植物动物组织。最典型的多糖药物是肝素, 已在临床应用80多年, 迄今仍经久不衰, 且不断有新的用途发现。细胞表面的膜由多糖 多肽复合物组成, 它参与细胞间的粘附、细胞间的信息分子在传导受精、发育、分化、神经系统与免疫系统的衡态维持起重要作用; 炎症、自身免疫性疾病、老化、癌症、感染等均与多糖的生物功能密切相关; O Glc NAc 对蛋白质的糖基化与蛋白质磷酸化具有相似的生物学功能。已发现多糖类的生物功能十分多样, 具有广泛而独特的药理、药效作用:
促吞噬肽具有显著免疫调节作
用和抗肿瘤作用; 胰岛素原分子中的C 肽可用于治疗 、 型糖尿病的并发症; 从猪脑获得99肽(MW为12000、pI 7 1) 有很强镇痛作用; 来自毒蜘蛛的33
肽, 其镇痛作用比吗啡强100倍, 且无成瘾性。2 3 蛋白类生化药物
2 3 1 神经诱导生长因子 神经损伤过程中, 产生的一种神经诱导生长因子, 其分子量为18KD, pI 5 2, N 端序列为PEPAWSAPAP 。
2 3 2 鲨鱼软骨新生血管抑制因子 从姥鲨中分离纯化的SC DI(MW为16100, pI 8 15) , 对 型胶原酶、内皮细胞DNA 合成、角膜新生血管和菌素荷瘤小鼠肿瘤血管生长有明显抑制作用。
2 3 3 肿瘤细胞抑制蛋白 从牛骨髓分离纯化得到一种具有抑制肿瘤作用的糖蛋白(MW 65000) 对白血病P388细胞和HL 60细胞均有抑制作用。2 3 4 红细胞生成调控因子P59蛋白质 从尿中分离得MW 为59000的P59蛋白质, 可促进鼠胎肝细胞红系集落的形成, 可刺激网织红细胞的生成, 能改善大鼠肾性贫血症状, 对尿毒症病人的贫血症状有明显疗效。
2 3 5 鲨肝细胞再生刺激因子 从鲨鱼肝纯化获得MW 为146000、pI 为5 6的SHRF 对多种肝炎模
(1) 调节免疫功能:如黄芪多糖、茯荟多糖、猴头菌多糖、人参多糖、灵芝多糖、党参多糖、银耳多糖等。
(2) 抗凝、溶栓作用等:如肝素、黑木耳多糖。(3) 抗肿瘤作用:如香菇多糖、冬虫夏草多糖、卡介菌多糖、灰树花多糖、云芝糖肽, 猪苓多糖、碳团菌多糖、牛膝多糖、刺参酸性多糖、海藻多糖等。
(4) 抗氧化作用:如山茱萸多糖、何首乌多糖、铁筷子多糖、泥鳅多糖、金樱子多糖。
(5) 抗幅射、抗突变、抗遗传损伤作用:如南沙参多糖、紫球藻多糖, 紫菜多糖, 酸枣仁多糖等。
(6) 降血脂、防治冠心病:如低分子量肝素、硫酸软骨素、茶叶多糖、海带多糖、金耳菌多糖。
(7) 降血糖作用:如南瓜多糖、乌龙茶多糖、青钱柳多糖、枸杞多糖、孔石莼多糖。
(8) 抗病毒作用:海藻硫酸酯、大蒜多糖、红景天多糖。
(9)抗过敏、用于哮喘与气管炎防治:如卡介菌多糖、麦冬多糖。
(10) 增强记忆功能:如黄精多糖。
(11) 多糖疫苗:如肺炎球菌多糖疫苗、嗜血流感杆菌多糖疫苗, 幽门螺杆菌多糖疫苗
多糖类药物研究已从一般药效学研究向分子作用机制研究深入进行, 并通过构效关系研究对多糖进行化学修饰与改构, 以改进多糖的理化性质和生物活性, 如牛膝多糖原来无抗病毒作用, 经硫酸化后即具有抗乙肝病毒活性。3 天然生化药物研究的几种重要途径3 1 应用基础研究成果, 开发新的生化药物
已发现作为药物的生化活性物质仅是机体内存在的活性物质的很小部分。通过基础研究还在不断发现一些新的活性物质, 如从大脑、小脑发现了对记忆、睡眠、计划生育和内分泌等有重要影响的物质。
对动物与人体的呼吸系统的研究发现, 呼吸功能除受肾上腺素能神经和胆碱能神经的调节外, 还受非肾上腺素能和非胆碱能神经的调节, 此
类神经调节系统的递质主要是多种神经肽。结果从心房中分离到心钠素、从大脑中分离到脑钠素都具有强大的利尿、利钠、降压和调节心律作用, 为寻找心血管系统生化药物开辟了新领域。通过现代生物分离工程和仪器分析手段, 对体内微量
存在的生化物质如细胞因子、转移因子、胸腺因子等生化活性物质不断地获得分离、纯化和结构测
定, 并深入地开展结构与功能研究, 从而使这类生化药物成批地发现, 进行研究开发。
3 2 扩大新的生物资源, 进行高通量筛选和鉴定新的生化活性物质
随着分离、纯化和鉴定手段的不断更新, 近几年来供作生化活性物质筛选的生物资源也不断扩大, 从而不断发现一些活性高、结构新、作用独特的新型生化活性物质。从海洋、湖沼生物、昆虫和低等生物(如藻类) 和毒蛇等发现了许多新的生化活性物质, 如海蛇多肽用作神经系统疾病治疗药物, 蜂毒素具有抗肿瘤和抗血栓作用, 还用作风湿性关节炎治疗剂。蝎毒中获得了镇痛肽, 抗炎多肽和抗癫痫多肽, 从毒蜘蛛中获得虎纹多肽、有很强镇痛作用, 从吸血蝙蝠中获得高效特异溶栓剂等。3 3 应用噬菌体, 展示技术建立活性多肽化合物库, 筛选开发活性小肽
[9]
许多活性多肽已用作酶的抑制剂, 受体的拮抗剂或激动剂, 而这些小肽在体内原先是以大分子蛋白合成的, 而后才降解和分泌行使生物功能。胰岛素原切去C 肽才成为活性胰岛素; 促黑皮质激素原(POMC) 经降介可释放12种活性多肽, 如AC TH(39肽) 、 促黑激素(13肽) 。还有表皮生长因子, 它是13肽, 但它的前体是一个1200个氨基酸残基组成的大蛋白质。在自然界, 生物已经通过进化形成了大分子蛋白生成活性多肽的途径, 因此许多天然蛋白质分子很大, 但它们的活性部位却是一个小肽片段, 如胞外基质中的纤连蛋白和层连蛋白内的三肽(RCD) 和5肽(PDSGR 与YICSR) 就是细胞粘附活性中心。又如转铁蛋白具有抗菌力, 其中17~41这段25肽就有抗菌活力和免疫调节功能, 现已商品化。因此可以从蛋白质制取小肽, 作为开发新药和设计新药的先导物。得到小肽的方法有酶解法、化学合成法、噬菌体展示技术法。
噬菌体展示技术是从随机肽库中直接筛选受体的全部配体的方法, 其原理是在M13噬菌体的外壳蛋白p 和p 的基因中随机插入任意大小的多聚核苷酸片段(可以通过DNA 改组技术制备) , 例如插入约50个核苷酸片段, 就可以建立由15个氨基酸残基组成的随机肽率。每个序列不同的噬菌体, 就是一个克隆, 通过配体多次亲和筛
选, 就可以获得专一克隆, 再经测序, 就可以获得专一肽段序列。此技术已用于抗原表位及其类似
表1 利用噬菌体展示技术筛选活性多肽与小肽模拟物
模拟物葡萄糖/甘露糖Gal 1 3Gal Lewis Y 抗原Lc 4Cer 鞘糖脂
A 型链球菌细胞壁多糖B 型链球菌 型荚膜多糖新型隐球菌荚膜多糖 葡萄糖淀粉酶抑制剂链霉抗生物素
1
物的筛选与鉴定, 也可以用此技术获得各种类型分子的肽类模拟物(表1) 。
结 构含YPY 的小肽DAHWESWI APWLY
VPPXFXXX Y RPXXY
WENWMMG NA DWX WD, WDGQ
KCHFEECLAYA TPSLAA 1含HPQ 的小肽
用 途
和伴刀豆球蛋白A 结合异种器官移植疫苗疫苗疫苗疫苗疫苗
降血糖药物模拟抗生素
此肽仅在两个半胱氨酸形成二硫键时才有活性
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3 4 通过蛋白组学技术发现和研究天然生化活性物质[10]
蛋白质组学是研究细胞全部蛋白质的表达状
态和功能状态, 是当前发现新药的一个有效新技术
[11]
。通过荧光染色和免疫印迹技术可以达到
在每个细胞检出1~10个拷贝水平, 其灵敏度已和基因组技术相当, 通过此技术可以鉴定与疾病发生的相关特异蛋白; 可以研究发现信号转导分子; 还可以用于研究药物的作用机制与毒理作用, 从而发现新的活性物质和用作药物筛选的新靶点以及用于临床诊断的标志蛋白。如通过多元色谱与双向电泳分析, 系统地发现了五步蛇毒中多种降纤酶成分和抗肿瘤活性物质以及神经生长因子和出血毒成分等。
研究表明, 天然生化药物仍为现代生物药物研究与开发的重点领域, 具有广阔的临床应用前景。
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Research and Development on Biochemical Medicine
W U Wu Tong 1, W ANG You Tong 2, WU Wen Jun 2
12
School o f Li f e Science and Technology , China Pharmaceutical University ; Editorial Board o f Pharmaceutical Biotechnology , Nanjing, 210009, China
ABSTRAC T Bi ochemical medicine from natural active substances in organism was an i mp ortant basis on research and developmen t of new biop harmaceutics. The progress on develop ment of biochemical medicine in China and research of vari ous bi ochemical medicine in the world were reviewed. Several methods on research of biochemical medicine from nature products were discussed, the results showed that biochemical medicine was an important area in research of new biopharmaceutics and had attractive application prospects in clinic. KEY WORDS Biochemical medicine; Muticomponent biochemical medicine; Peptidemedicine; Protein medicine; Polysaccharide medicine; Proteomic technology