环介导等温扩增技术

・２７０

堂坐箜燕塑唑噬苤查！！！兰生！旦筮！！鲞箜！塑ｇ！也』旦！！盟曼！！Ｐ堡望蔓垒Ｐ垂！！！！！：Ｙ！！：！！：盟！：兰

．论著．

环介导等温扩增技术在下呼吸道感染常见

病原体检测中的应用

陈愉生林明

王大璇李鸿茹王璨

闫胜龙

陈蚊颖

张祥娥邵慧

许能銮

胡辛兰

高占成

【摘要】

目的应用环介导等温扩增（ＬＡＭＰ）技术对下呼吸道感染患者痰标本中常见致病菌进

行核酸检测，调查病原菌的分布，研究ＬＡＭＰ技术对下呼吸道感染病原体检测的临床意义。方法收集福建省立医院呼吸科下呼吸道感染患者２８９例的合格痰标本２８９份，ＬＡＭＰ技术检测病原体，分析下呼吸道感染病原菌的分布，并与传统的培养法进行比较。将细菌浓度＞１

ｘ

１０３拷贝／ｍｌ的病例分

为初治已覆盖病原体组和初治未覆盖病原体组，比较两组患者年龄、有无基础疾病、抗感染治疗时间、总住院时间、初治有效率及治愈率。结果

２８９例患者中培养法阳性４４例（１５．２％）。ＬＡＭＰ技术检

测以细菌浓度＞１×ｔ０３拷贝／ｍｌ为界值，判定为阳性结果的有１２４例（４３．０％）。下呼吸道分离的病原菌中细菌１４４株（７７．８％），非典型病原菌４１株（２２．２％）；革兰阴性杆菌为主要致病菌，依次为铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌及肺炎链球菌。初治已覆盖病原体组（９５例）和初治未覆盖病原体组（２９例）的总住院时间分别为（１３．９±９．１）和（１６．３±１１．２）ｄ，差异有统计学意义（ｔ＝一２．０８３，Ｐ＝０．０３９）；初治有效率两组分别为３１．０％（２９／９５）和９３．１％（２７／２９），差异有统计学意义

（Ｘ２＝３１．０，Ｐ＜０．叭）；两组的抗感染治疗时间［（１３．９±９．１）和（１６．３±１１．２）ｄ］比较，差异无统计学

意义（ｔ＝一１．０７３，Ｐ＝０．２８５）；两组的治愈率分别为８４．２％（８０／９５）和９５．７％（２８／２９），差异无统计学意义（ｘ２＝０．６，Ｐ＝０．４）。结论ＬＡＭＰ技术简便，可快速扩增肺部感染患者痰液中常见致病菌核酸，检出率明显高于传统的痰培养法。ＬＡＭＰ技术有利于治疗前明确致病菌并进行针对性治疗，缩短患者的住院时间，提高初始治疗的有效率。

【关键词】

Ｔｈｅ

呼吸道感染；细菌；环介导等温扩增技术

ａｐｐＨｃａｆｉｏｎｏｆｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｏｍｍｏｎ

ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ

ＣｈｅｎＹｕｓｈｅｎｇ４，Ｗａｎｇ

Ｄａｘｕａｎ，Ｌｉ

ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ

ｂａｃｔｅｒｉａｉｎｌｏｗｅｒｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ

ｔｒａｃｔ

Ｈｏｎｇｒｕ，Ｃｈｅｎ

Ｗｅｎｙｉｎｇ，ＺｈａｎｇＸｉａｎｇ’ｅ，ＳｈａｏＨｕｉ，ＸｕＺｈａｎｃｈｅｎｇ．女ＴｈｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：Ｃｈｅｎ＠１６３．ｃｏｒｎ

Ｎｅｎｇｌｕａｎ，Ｌｉｎ胧昭，Ｗａｎｇ

Ｃａｎ，ＹａｎＳｈｅｎｇｌｏｎｇ，ＨｕＸｉｎｌａｎ，Ｇａｏ

ｏｆＲｅｓｐｉｒａｔｐｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＦｕｊｉａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０００１，Ｃｈｉｎａｙｕｓｈｅｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｓｌｙｙｙｗｂ＠１２６．ＣＯｒｎ；ＧａｏＺｈａｎｃｈｅｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｇａｏｚｈａｎｅｈｅｎ９５４４６

Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｃｏｍｍｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｂａｃｔｅｒｉａｏｆｌｏｗｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】

ｔｒａｃｔ

Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ

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ｌｏｗｅｒｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｔｒａｃｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎＦｕｊｉａｎＰｒｏｖｉｎｃｅｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＬＡＭＰｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅ

ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｂａｃｔｅｒｉａｗａｓａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃａｓｅｓ（ｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｈｏｓｅｓｐｅｃｉｆｉｃｂａｃｔｅｒｉａｌ

ｃｏｐｉｅｓ

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ｂａｃｔｅｒｉａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ＞１×１０３ｅｏｐｉｅｓ／ｍｌａｓｃｕｔｏｆｆｖａｌｕｅ．ｓｈｏｗｅｄｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓ

ＬＡＭＰ

ｉｎ

ｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈ

１２４

ｐａｔｉｅｎｔｓ

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－０９３９．２０１４．０４．０１０

基金项目：福建省科技计划项目（２００９Ｙ００１０，２０１２Ｙ００１６）；国家“８６３计划”课题（２００６ＡＡ０２２４Ａ９）

作者单位：３５０００１福州，福建医科大学省立临床医学院福建省立医院呼吸科（陈愉生、李鸿茹、张祥娥、许能銮、林明），ｌ晦床医学院（王大璇），急诊内科（陈炊颖），高于科（邵慧），检验科（胡辛兰）；北京博奥生物有限公司（王璨、闫胜龙）；北京大学人民医院呼吸与危重医学科（高占成）

通信作者：陈愉生，Ｅｍａｉｌ：ｓｌｙｙｙｗｂ＠１２６．ｃｏｒｎ；高占成，Ｅｍａｉｌ：ｇａｏｚｈａｎｃｈｅｎ９５４４６＠１６３．ＣＯＢ

万方数据

生堡缱筮塑哩咝苤盍！Ｑ！垒生！旦筮！！鲞笠！塑鱼！也』坠！！婴垦！！Ｐｉ！望堡：垒Ｐ巫！！Ｑ！垒：！！！：！！：盟！：兰（４３．０％）．Ｔｈｅ

ｏｆａｔｙｐｉｃａｌ

ｌｏｗｅｒｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｔｒａｃｔｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎｃｌｕｄｅｄ１４４ｓｔｒａｉｎｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａ（７７．８％），ａｎｄ４１ｓｔｒａｉｎｓ

ｐａｔｈｏｇｅｎｓ（２２．２％）．Ｇｒａｍ—ｎｅｇａｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａｗｅｒｅｔｈｅｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｓ，ｓｕｃｈａｓ

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｈｉｎｆｌｕｅｎｚ粥，ＫｌｅｂｓｉｅＵａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ａｎｄＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｉｎ９５

ｃａｓｅｓ

ｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｔｈｅｒａｐｙｈａｄｃｏｖｅｒｅｄｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｓ．ｗｈｉｌｅｉｎ２９ｃａｓｅｓｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｔｈｅｒａｐｙｈａｄｎｏｔ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｆｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｘ２＝３１．０，尸＜０．０１）ａｎｄｔｈｅｔｏｔａｌｄａｙｓｏｆｈｏｓｐｉｔａｌｓｔａｙ（ｔ＝一２．０８３，Ｐ＝０．０３９）

ｉｎ

ｔｈｅｇｒｏｕｐｗｈｏｓｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｈａｄｃｏｖｅｒｅｄｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｔｈｅｏｔｈｅｒ

ｎｏ

ｇｒｏｕｐ．Ｈｏｗｅｖｅｒ．ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｄｕｒａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉ—ｂａｃｔｅｒｉａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ｔ＝一１．０７３．

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Ｐ＝０．２８５）ａｎｄ

ｃｕｒｅ

ｒａｔｅｓ（ｘ２＝０．６，Ｐ＝０．４）ｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ

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ｇｒｏｕｐｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ

ＬＡＭＰｍｅｔｈｏｄ

ｃａｎ

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ｋｎｏｗｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ

ｂａｃｔｅｒｉａｂｅｆｏｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ

ｔｈｅｒｅｆｏｒｅｍａｙｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｃｈｏｉｃｅｏｆｉｎｉｔｉａｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｔｈｅｒａｐｙ．

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】

Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ

ｔｒａｃｔ

ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ；

Ｂａｃｔｅｒｉａ；Ｌｏｏｐｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ

下呼吸道感染居各类感染之首，其病死率居高

不下的主要原因是没有及时获得正确的诊断和治疗。传统的细菌学检验与鉴定需要进行细菌培养或免疫学检测，费时费力，对于部分培养周期长的细菌或需要特殊培养条件的细菌往往不能及时为临床提供准确的鉴定结果，因而延误病情的治疗。因此只有根据病原体检测结果合理使用抗生素，才能使大部分下呼吸道感染患者得到及时有效的治疗。２０００年Ｎｏｔｏｍｉ等¨ｏ首先发布了环介导等温扩增（１００ｐ—

ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ

进行细菌鉴定。ＬＡＭＰ技术检测阳性的１２４例均在人院当天即给予抗生素治疗，并对初治已覆盖病原体组和初治未覆盖病原体组进行比较。

３．结果分析：根据所检测的１１种病原菌中每

种细菌４管标准品的理论拷贝数和出峰时间确定标准曲线。根据痰标本的出峰时间，利用标准曲线推算出模板浓度。痰标本大致细菌浓度的推算：

痰标本中的细菌浓度（拷贝／ｍ１）＝模板浓度

（拷贝／斗１）×１００／０．６。以细菌浓度＞１×１０３拷贝／ｍ１判定为阳性结果ｐｏ。

４．统计学处理：结果数据均采用ＳＰＳＳ１７．０统计软件分析。配对的计数资料之间两两比较采用

ＭｃＮｅｍａｒ

ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）技术，以其

特异度强、敏感度高、快速准确和操作简单、技术水平要求相对较低及所需试验器材简单等优点被广泛应用于生物学的各个领域，可被推广用于感染性疾

ｘ２检验，若有１格理论频数＜１时采用

病的诊断和病原体的检测。

对象与方法

１．对象：收集２００９年１月至２０１０年１２月福建省立医院呼吸科住院肺炎患者２８９例，男１９８例，女９１例，年龄２２～８９岁，平均（６４．３－－４－＿１７．０）岁。其

Ｆｉｓｈｅｒ精确检验，双侧检验进行统计学推断。Ｐ＜

０．０５为差异有统计学意义。

结

果

１．ＬＡＭＰ法检测结果：应用实时荧光定量方法检测，测定出的痰标本中细菌浓度分别以１×１０３拷贝／ｍｌ和１×１０５拷贝／ｍｌ为界值，计算每个界值范围内阳性结果的例数，具体数据见表１。

中社区获得性肺炎１７４例，慢性阻塞性肺疾病急性

加重６０例，支气管扩张伴感染４３例，慢性支气管炎

急性发作８例，医院获得性肺炎４例。人选患者均

符合中华医学会呼吸病学分会制定的社区获得性肺炎拉。和医院获得性肺炎诊断标准旧Ｊ。２８９例共收集合格痰标本２８９份。将ＬＡＭＰ技术检测阳性的１２４例，分为初治已覆盖病原体组（９５例，男６２例，女３３例）和

２８９份标本中细菌浓度＞１×１０３拷贝／ｍｌ为界值的判定为阳性结果，共有１２４例（４３．ｏ％），共检

测出病原菌１８５株，其中细菌１４４株，非典型病原菌４１株；革兰阴性杆菌１２２株，革兰阳性球菌２２株。革兰阴性杆菌中致病菌依次为铜绿假单胞菌４０株（２１．６％），流感嗜血杆菌３４株（１８．４％），肺炎克雷伯菌２０株（１０．８％），嗜麦芽窄食单胞菌１２株（６．５％），鲍曼不动杆菌１１株（５．９％），大肠埃希菌５株（２．７％）。非典型病原菌中肺炎支原体３９株

初治未覆盖病原体组（２９例，男２２例，女７例）。

２．研究方法：痰液收集及处理、痰样品细菌核酸提取流程及痰样品核酸ＬＡＭＰ反应流程详见文

献［４］。传统的细菌培养及鉴定方法是将下呼吸道分泌物标本２ｈ内分别接种于血平板、巧克力平板

和中国蓝平板上，置于３５℃恒温培养箱中孵育

２４

（２１．１％），肺炎衣原体２株（１．１％），军团菌未检

出。革兰阳性菌中肺炎链球菌２０株（１０．８％），金黄色葡萄球菌２株（１．１％）。１２４例阳性患者中，８０例（６４．５％）为单一致病菌感染，４４例为复合病

ｈ，挑取优势菌落进行细菌鉴定。应用法国生物

梅里埃公司的ＶＩＴＥＫ２．ｃｏｍｐａｃｔ全自动细菌分析仪万方数据

史堡箜蕉塑唑咝苤壶！！！生生兰旦筮！！鲞筮！翅ｇ！也』！！！！丝壁！Ｐ堡望亟垒Ｐ巫！！！！垒：ｙ！！：！！：盟！：！表１不同界值范围内细菌阳性结果比较（株数）

注：Ｓｐｎ：肺炎链球菌；ｓａｕ：金黄色葡萄球菌；ｃｐｎ：肺炎衣原体；Ｍｐｎ：肺炎支原体；ｈｉｎ：流感嗜血杆菌；ｓｍａ：嗜麦芽窄食单胞菌；ａｂａ：鲍曼不动杆菌；ｐａｅ：铜绿假单胞菌；ｋｐｎ：肺炎克雷伯菌；ｅｅｏ：大肠杆菌

原菌感染（３５．５％），其中２种病原体混合感染３６例

（２９．０％），３种病原体混合感染６例（４．８％），４种

病原体混合感染１例（０．８％），５种病原体混合感

染１例（０．８％）。

２．ＬＡＭＰ技术和培养法对各种病原菌检出率

的比较：ＬＡＭＰ技术检测的肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌的阳性率高于培养法，两者比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），但ＬＡＭＰ技术仅检出肺炎支原体３９株，肺炎衣原体

２株，因样本量少未进行比较。故只能对其他８种

常见细菌进行比较，具体结果见表２。

表２环介导等温扩增技术和培养法对各种病原菌

菌株检出率的比较（２９８例）

３．不同基础疾病患者病原菌的构成：２８９例中，社区获得性肺炎患者１７４例，慢性阻塞性肺疾病急性加重患者６０例，支气管扩张伴感染患者４３例，慢性支气管炎急性发作患者８例，医院获得性肺炎患者４例，其病原菌构成见表３。

４．ＬＡＭＰ技术检测结果：ＬＡＭＰ技术检测的１２４例，其中男８３例，女性４１例，年龄１７—８９岁，平均（６０±１５）岁。住院天数为３～５６ｄ，平均（１４±９）ｄ，均在人院当天给予抗生素治疗，选择频率较高

的药物主要有喹诺酮单用或联合大环内酯类、三代

头孢菌素、ｐ．内酰胺类／Ｂ一内酰胺酶抑制剂。初治未覆盖病原体组和初治已覆盖病原体组年龄、是否有基础疾病、抗感染治疗时间、总住院时间、初治有效

率以及治愈率见表４。死亡患者６例，均为老年合万方数据

并基础疾病患者。

表３不同基础疾病患者的病原菌构成（株数）

表４环介导等温扩增技术检测阳性患者的

一般情况、初始治疗有效率和治愈率

注：８ｉ

４－ｓ

ＬＡＭＰ技术检测的病原学结果显示，初始治疗

未覆盖病原体组的病原菌谱前３位依次为铜绿假单胞菌（３１％）、肺炎克雷伯菌（２７．６％）和肺炎支原体（２０．６％）；初始治疗覆盖病原体组的病原菌谱依次为流感嗜血杆菌（２７．４％）、肺炎支原体（２５．３％）及

铜绿假单胞菌（１６．８％），见表５。

讨

论

本课题组前期研究使用环介导等温扩增技术检测呼吸道病原体的敏感度明显高于普通细菌培养法，有望在临床得到使用…。本研究进一步分析利

用该技术检测１２４例致病菌阳性患者致病菌的构成

状况，其中革兰阴性杆菌１２２株，占ｌ８５株菌株中

壹丝壹医塑唑哩苤盍！Ｑ！垒生垒旦筮！！鲞筮！翅鱼！地』！！垒丝垦塑也旦亟垒画！！Ｑ！垒：！尘：！！：丛生

表５两组患者病原学分布情况（例）

注：括号内为百分比（％）

的６５．９％，与蒋丽莉等。６１报道的结果一致，表明目前呼吸科病房下呼吸道感染的病原菌以革兰阴性杆菌为主。本研究结果显示，革兰阴性菌依次为铜绿

假单胞菌、流感嗜血杆菌及肺炎克雷伯菌，其原因可能与呼吸科住院患者的年龄偏大、多数患者合并基础疾病、病情严重且多数患者人院前曾自服抗生素

或者有院外诊治史有关。本研究中慢性阻塞性肺疾病急性加重患者６０例，同时少数患者由于长期气道疾病导致气道结构改变而存在铜绿假单胞菌的定

植，因此可能是本研究中铜绿假单胞菌检出率高的原因，与王望东等＂ｏ的结果类似。在本研究中社区获得性肺炎患者占病例总数的６０．２％，而流感嗜血杆菌的检出率高达１８．５％，表明目前流感嗜血杆菌仍为社区获得性肺炎的主要致病菌”１。本研究中

肺炎支原体（２０．７％）与肺炎链球菌（１８．５％）的检

出率与刘又宁等一。的结果相近。另外，本研究中以

２种病原体混合感染者居多，提示临床医生在使用抗生素时要考虑联合应用，有效覆盖致病菌。本研究结果显示，社区获得性肺炎病原菌检出阳性率达６３．８％，其中前４位依次为肺炎支原体、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌，与刘又

宁等［９ｏ的结果相似，但铜绿假单胞菌检出率高考虑为所人选患者大部分为老年患者，多有长期的基础

疾病史，且人院时大部分患者已使用过抗生素。文

献报道５０％～８０％的慢性阻塞性肺疾病急性加重是由于呼吸道感染所致，其中细菌感染占４０％～５０％［１０－１２］，本研究中６０例慢性阻塞性肺疾病急性加重患者中３７例检测出病原菌，前４位依次为流感嗜

血杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。张金松等¨纠发现，慢性阻塞性肺疾病急性加重患者痰标本中分离确认的８２株病原菌依次为铜绿

万方数据

假单胞菌、肺炎克雷伯菌和不动杆菌属，与本研究结

果相似。文献报道，支气管扩张稳定期患者中５０％以上呼吸道存在潜在致病菌定植¨４｜，最常见的为铜

绿假单胞菌，而罗志扬等ｎ副发现，支气管扩张感染加重期患者呼吸道分泌物的培养结果依次为铜绿假单胞菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌。本研究中４３例支气管扩张伴感染中３３例检测出细菌，其中以铜绿假单胞菌为多（１３株），其余菌种检

出量偏少，可能与样本量偏少有关，有待扩大样本量进一步研究。

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（收稿日期：２０１３－０８－０２）

（本文编辑：李文慧）