交替氧化酶的功能性表达使人体细胞中抗霉素A诱导的活性氧产量下降

交替氧化酶的功能性表达使人体细胞中

抗霉素A 诱导的活性氧产量下降

摘要

交替氧化酶在植物、真菌和某些原生生物线粒体抗氰呼吸中起关键性作用，接下来，我们要讲一个关于产热的臭鼬科卷心菜成功的赋予人体细胞抗氰作用的故事。在半乳糖介质中，带有线粒体锚定AOX 蛋白的海拉细胞在响应抗霉素A ——呼吸链复合体Ⅲ的特定抑制剂——时，显著减少了活性氧的产生。结果表明，臭鼬科卷心菜能够用来产生交替的呼吸途径，这可能对治疗各种线粒体疾病非常有价值。

关键词：交替氧化酶，抗霉素A ，海拉细胞，线粒体，活性氧，Symplocarpus renifolius 1引言

交替氧化酶（AOX ）是一种线粒体酶，它在包括哺乳动物在内的真核生物的抗氰呼吸中起关键性作用。AOX 在电子传递链中扮演交替终端氧化酶的角色，它催化泛醌的氧化，通过水化减少分子氧的含量。因此，人们相信由于绕开了细胞色素呼吸途径的两个质子转移途径，氧化还原反应产生的能量没有合成A TP 而是转化成热能。实际上，能量的突然大量产生是发生在产热植物（例如，海芋属百合花家族）开花期，而这要归因于抗氰呼吸途径的上调。除了产热植物，之前对于非产热植物的研究表明，AOX 的参与可以阻止泛醌的持续还原并保证了电子传递链（ETC ）和三羧酸循环（TCA ）的持续进行，否则将会导致活性氧的产生。

在许多生物体中，活性氧参与细胞信号或损伤，大部分内源性的活性氧产生于线粒体电子传递链，尤其是复合体Ⅰ和Ⅲ。在人体中，活性氧的无限增长被认为是很多疾病的病因，包括老化、癌症、代谢综合征、神经疾病和线粒体疾病。因此，猝灭过剩的活性氧是治疗的主要目标之一，目的在于减轻呼吸链缺陷导致的不良后果。

研究表明，人类细胞通过异位表达来自玻璃海鞘的AOX 基因，表现出抗氰呼吸作用。研究还表明，AOX 的表达能消除抗霉素A 对超氧岐化酶活性的诱导。然而，尚不明确人类细胞中线粒体AOX 能否阻止抗霉素A 诱导的ROS 的增加。

到目前为止，我们了解到，来自产热臭鼬科卷心菜的AOX 在海拉细胞中能功能性表达，并且AOX 表达降低了抗霉素诱导的ROS 的产量。有趣的是，这种AOX 对于线粒体氧化胁迫的保护作用是在半乳糖介质中细胞的主动呼吸中观察到的。

2材料和方法

2.1亚细胞定位和Western 杂交

用亚细胞蛋白质组提取工具进行转染基因产物的亚细胞定位。转染24小时后，根据制造商说明，将海拉细胞胰蛋白酶化并分馏。用Bradford 法测蛋白浓度并以牛血清蛋白作为标准。用SDS-PAGE （12.5%的聚丙烯酰胺凝胶）分馏样品，然后用半干转印法转印到聚偏二氟乙烯膜上。预染的蛋白质标记用做分子质量评估。室温条件下，将膜于Tris 缓冲液（含0.1%的Tween 20）中的脱脂牛奶中孵化1小时，然后在含有AOX 抗体、µ-钙蛋白酶和复合体Ⅲ核心亚基2的TBS-T 中4℃过夜。根据以上方法完成检测。

2.2 耗氧量测定

细胞经胰蛋白酶化，活细胞的数量用台盼蓝排斥实验测定。细胞内源性呼吸用克拉克型电极于37℃在个体生长介质中测量。每个实验中，37℃空气饱和水的氧浓度被估测为200µM 。

2.3 流动细胞计数法测量ROS 产量

胞内ROS 的产量借助于对氧化敏感的荧光探针染料，荧光探针染料是可透过细胞的ROS 指示剂，尤其可以反映H 2O 2。这种荧光探针染料允许细胞内被非酯酶去乙酰基化的成分吸附细胞内成分，可长时间存在于细胞内。胞内的脱乙酰基化的H 2DCF 只有氧化后才发荧光。转染24h 后，将细胞胰蛋白酶化化并转移到新的生长介质中。然后，用5µM CM-H 2DCFDA 37℃孵化30min 。37℃用不同浓度的AA 处理各组细胞30min 。根据说明，用磷酸盐缓冲液清洗后，DsRed2-nuc 阳性细胞的DCF 荧光强度直接通过流式细胞仪分析得到。每个实验要收集并分析10000个DsRed2-nuc 阳性结果。

3结果

3.1在葡萄糖和半乳糖介质中生长的海拉细胞的线粒体中，AOX 和E217A 都作为非共价偶联的二聚体表达

为了分析人体细胞中的臭菘属AOX 功能，我们构建了一个AOX 质粒，它编码的成熟的臭菘属AOX 融合到人体细胞色素C 氧化酶Ⅷ线粒体定位信号的N 端。一个E217A 质粒的Glu-217被替换为Ala ，产生了一个功能缺失的亚铁中心。转染后，细胞在非还原的条件下用AOX 单克隆抗体对S. guttatum AOX进行免疫印迹。通过控制、AOX 或者E217A 质粒转染24小时后，从葡萄糖或半乳糖介质中生长的细胞中分离胞质基质或线粒体组分。图1B 表明AOX 蛋白和线粒体标志蛋白——复合体Ⅲ亚基核心2——一起被分馏。而且，两种线粒体靶定AOX 蛋白以成熟形式显著表达，这两种蛋白的预计分子量为32 kDa，在两者线粒体组分中，几乎没有氧化酶二聚体的信号分子。在E217A 转染的线粒体中，微弱的检测到带有线粒体靶定信号序列的AOX 蛋白。在两种介质的细胞线粒体组分中，E217A 比AOX 积累得略多一些。

3.2是AOX 而不是E217A, 赋予海拉细胞抗氰呼吸的能力

为了确定是否是AOX 赋予了人体细胞抗氰呼吸的能力，我们测定了37℃不含丙酮酸的缓冲液中的细胞内源性耗氧量。如图S1A 和S1B 所示，转染后24h ，细胞表现出对1 mM氰化物的强烈抗性并被0.1 mM的n-PG （一种AOX 的特殊抑制剂）完全的抑制。另一方面，控制和E217A 转染的海拉细胞的耗氧量，在氰化物存在的情况下，并不受加入的n-PG 显著影响。基础内源耗氧率分别为：葡萄糖中的细胞34.3 ± 4.4%，半乳糖中的细胞28.6 ± 4.4%。加入1 mM的丙酮酸后，半乳糖中比葡萄糖中生长的表达AOX 的细胞的抗氰呼吸增加的更显著。

为了进一步估测1 mM丙酮酸对葡萄糖介质中生长的表达AOX 的细胞线粒体抗氰呼吸的影响，我们在37 °C 条件下，用转染控制质粒、AOX 或E217A 的细胞线粒体测量耗氧量。如图S2所示，在转染控制质粒和E217A 的细胞中加入0.5 mM KCN后，呼吸作用显著下降。然而，持续向表达AOX 的线粒体中加入0.5 mM KCN导致显著的抗氰呼吸和对n-PG 敏感的呼吸作用。另外，加入丙酮酸而不是a-酮戊二酸，引起了抗氰呼吸2.3 ± 0.2倍增加。同时，我们注意到，异源的AOX 的表达对基础的和状态2的呼吸作用无显著影响。

3.3葡萄糖介质中的海拉细胞内的丙酮酸含量比半乳糖介质中的高

因为丙酮酸激活葡萄糖介质中海拉细胞的AOX 的效果不好，所以，我们怀疑是否生长条件改变了內源的有机酸水平，尤其是丙酮酸的水平。我们用定量气相色谱/质谱分析法(GC/MS)对八种不同有机酸的测量结果表明，葡萄糖介质中生长的海拉细胞中丙酮酸含量大约比半乳糖介质中的高四倍。然而，在葡萄糖介质中转染控制质粒和表达AOX 的胞内丙酮酸含量我显著差异。

3.4半乳糖介质中海拉细胞中，是AOX 减少了抗霉素A 诱导的ROS 的产生，而不是 E217A

在两种介质的细胞中，为了确定抗霉素A 对耗氧量和ROS 产量的影响，我们用DCF 荧光流动细胞仪测量ROS 产量。如图3A 所示，两种细胞中耗氧量严重受低浓度的抗霉素A

的抑制。因为这些细胞没有转染AOX 表达质粒，所以外加的KCN 和n-PG 对耗氧量没有可检测的影响。ROS 产量用DCF 荧光强度检测，在半乳糖介质用抗霉素A 孵化的细胞中，ROS 的产量显著增加。

接下来，我们测定了抗霉素A 诱导的线粒体ROS 对两种介质中表达AOX 细胞的影响。如果AOX 功能发挥充分，AOX 的参与能使抗霉素A 诱导阻断的电子流沿旁路传导，从而阻止ROS 的产生。我们观察到，葡萄糖介质中生长的细胞的DCF 荧光强度没有显著增加；然而，在半乳糖介质中，在抗霉素A 的作用下，控制质粒和E217A 细胞的ROS 产量显著增加。与之相反，用抗霉素A 处理的表达AOX 细胞显著抑制ROS 的产生，荧光水平与未处理的细胞的相似。用0.1 mM n-PG处理表达AOX 的细胞后，我们有一次观测到ROS 的产生。

4讨论

最新报道指出，来自C. intestinalis的海鞘AOX 能够在人体细胞中表达并赋予线粒体抗氰呼吸的能力。然而，作者得出的结论是，由于AOX 表达细胞的非控制性死亡，植物AOX 在哺乳动物中表达得并不成功。因此，尽管高等植物AOX 蛋白在线粒体代谢中的重要性得到广泛研究，植物AOX 在哺乳动物细胞中的功能性分析还未报道过。

在这里，我们证实了臭菘属AOX 基因能成功在人体细胞中表达，并且赋予人类细胞线粒体抗氰呼吸的旁路途径。另外，我们的研究表明，臭菘属AOX 明显的减缓了抗霉素A 诱导哺乳动物细胞ROS 的产生。有趣的是，这种AOX 的对于抗霉素A 诱导ROS 的保护作用，只在半乳糖介质中呼吸速率更快的细胞中检测得到。

在我们目前的研究中，在葡萄糖介质细胞中和半乳糖介质细胞中分别加入1 mM的丙酮酸，后者比前者的抗氰呼吸作用更容易被激活。GC/MS分析表明，半乳糖介质细胞内的丙酮酸库比葡萄糖的小，说明半乳糖介质细胞的抗氰呼吸作用可能更多的被外源丙酮酸激活。最近报道，丙酮酸激酶从M1到M2的一个开关使得丙酮酸和乳酸含量增加，而氧消耗降低。因此，可能像报道的那样，丙酮酸激酶M2主要在葡萄糖介质细胞中表达，导致丙酮酸含量增加。有人建议，海鞘类AOX 也保护抗霉素A 诱导葡萄糖介质人类胚胎肾脏293 T 细胞ROS 产生，这一结论是基于60µM 抗霉素A 诱导16h 导致SOD 活性显著下降。但是，这些观察结果是在其他ROS 解毒酶可能上调的情况下得出的，如过氧化氢酶、硫氧还蛋白还原酶。最近的研究也表明，高浓度抗霉素A 不仅能结合细胞色素复合体Ⅲ的Qi 位点，也能结合抗氧化蛋白Bcl-2的BH3结构域。因此，目前用低浓度的抗霉素A 和短时曝光，直接测量胞内抗霉素A 诱导ROS 的产生的研究，首次证实了AOX 在阻止哺乳动物ROS 产生中的作用。

有趣的是，为什么在抗霉素A 处理的葡萄糖介质细胞中观测到ROS 减少？我们知道，家族的作用会抑制线粒体呼吸，可能有这种原因。依据这种可能性，斯纳和同事们表明线粒体非偶联羟基氰化物m-氯苯基腙与抗霉素A 的混合物引起葡萄糖介质海拉细胞ROS 显著增加，抗霉素A 单独作用效果微弱。另一种可能是，葡萄糖代谢的参与，它可能影响胞内抗氧化剂活性。例如，葡萄糖能诱导SOD 活性，产生过量的丙酮酸作为抗氧化剂和戊糖磷酸途径的中间物，在这里，抗氧化的谷胱甘肽氧化还原循环和NADPH 产生了。

Rustin 和同事们注意到海鞘AOX 在正常培养下没有活性，他们指出，如果AOX 有持续的活性，就会因为A TP 含量下降而对细胞生长不利。我们的研究结果还表明，尽管AOX 以非共价欧联二聚体形式表达，两种介质中的细胞耗氧率并没有显著增加。这一结果表明，Symplocarpus AOX在正常培养条件下几乎没有活性，只有复合体III 被抗霉素A 抑制等特殊条件下才被激活。

线粒体疾病一般是由于细胞色素途径功能障碍造成的，因为对ATP 的高需求量而对器官、组织造成伤害，包括大脑、心脏和骨骼肌。尤其，复合体I 缺陷是呼吸链功能障碍的主

要原因。ETC 活性损伤不仅在线粒体疾病中观测到，老年痴呆症和帕金森综合症中也有。而且，复合体III 与复合体Ⅰ和Ⅳ在生理上和功能上相互作用，它的活性影响其他复合体的活性。因此，我们的研究成果进一步指出，障碍或疾病都与功能失调的细胞色素片段相联系，尤其是复合体III 和 IV ，在人类线粒体基因治疗过程中可能被引入的Symplocarpus AOX减轻。

总之，目前的研究数据清晰地表明，Symplocarpus AOX在臭鼬卷心菜产热中扮演关键性角色。赋予人体细胞抗氰呼吸的能力并抑制了抗霉素A 诱导的ROS 的产生。Symplocarpus AOX 的功能性表达似乎是一个有价值的的工具，这个工具有助于理解不仅仅植物酶而且还有细胞色素路径突变与人类细胞病（如肿瘤发生、细胞凋亡和线粒体疾病）的发病机理的关系。

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