胶回收注意事项以及感受态细胞的制作

胶回收DNA注意事项

①切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。所以为了减少胶的体积，我们 就可以用相对比较薄的胶来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑胶。这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。

②主要还是DNA的浓度， 如果DNA浓度不够， 想胶小点也不可能。

③紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片， 其目的在于防止外源DNA的污染。

④利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段可能有以下几个原因：胶块未完 全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合 DNA，如pH太高，应作适当调整；漂洗液中未加入无水乙醇。

⑤可以改用去离子水洗脱。但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当调高其pH 值，以增加洗脱得率。

⑥洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除漂洗缓冲液，具体方法参见回收 效率低的解决方案。

⑦不可以使用更小洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提高浓度，因为说明书 提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。

⑧电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。如果后续实验对片段纯度要求较高，建议 即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。 ⑨琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下述原因：琼脂糖质量不好；含目的片段的凝胶再空气中放置过久， 使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃；制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。

关于胶回收切胶的一点注意事项

1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。

2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。

3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴树脂眼镜就

可以了。要是非常害怕紫外照射，或者对于胶有特殊要求，例如要求不含 EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。

4. 按照正常程序点marker跑胶，然后切下有marker的胶，EB染色，紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与marker间的相对位置已 知，根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。如果觉得很难判断，可以直接在marker边点少量的样，这样位置就容易确定了。

一. 提高胶回收量的办法

1) 增加电泳时的上样量。

2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。

3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。

4) 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。

5) 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。

6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30%异丙醇在加热溶解胶后的液体里。

7) 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟（大约需10分钟），以使乙醇充分挥发。

8) 最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱（不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱）；洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。

9) 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。

10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。

二. 几种PCR产物回收的详方法和步骤

1) 普通胶回收

如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手工回收，可以切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚/氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。另外好像还有冷冻法，没作过，不是很清楚。

2) 从低熔点凝胶回收DNA

纯化DNA片段 加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚（TE饱和，TE封在上

层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀），12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可用于目的基因结构分析，探针制备等）。

3) 扩增特异性好的PCR回收

如果PCR扩增特异性好，只是简单的PCR产物纯化回收，可以在PCR产物中加入50ug/ml 的蛋白酶K，37度1h，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1体积的醋酸钠，2.5体积的无水乙醇沉淀回收。

三. 不需胶回收就可直接连接的方法

1) 低温冷冻析出法

跑电泳时用低熔点的agarose胶，跑到一定时候，将目的条带所在的那一段胶切下，尽量切干净，让核酸直接暴露在胶的表面，并且，把底下没有脱氧核酸的那点胶也尽量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在负75度冰箱中10－30分钟，接着1，300rpm离心5－10分钟，取10ul上清，加入连接体系中。将其余的液体也吸出，储存在另一个管子中，做好标记，放在－20度备用。

2) 酶切后的直接连接

在你酶切后可以直接的加入连接酶和另外的片断进行连接是可以筛选出连接好的片断的。

四、一些注意事项

1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源DNA污染。

2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。

3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果你戴树脂眼镜就可以了。

4. 琼脂糖对回收率有一定影响，如果琼脂糖较多，可以增加溶胶液，保证体系盐浓度。影响回收率的因素主要是柱子填料必须在适宜的缓冲环境中（如果用柱子的话）。对于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%异丙醇。

5. 如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，枪头捣碎，过夜浸泡，即可。当然你要将100bp在胶中位置定好切下。已标记的探针用X片，未标记的用EB。

6. 选用回收效率较高的柱子，比如进口的Qiaquick spin column。

7. 参照分子克隆用低熔点胶回收。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂

电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收DNA片段。

附注：影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：

1) DNA分子大小 迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）

2) 琼脂糖浓度：logU=logU0 Krt 胶浓度，U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移率，t为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA

Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb

1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.

3) DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。

4) 所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm

5) 碱基组成与温度：一般影响不大4-30 ℃

6) 嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)

7) 电泳缓冲液 （0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。

2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。

3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

二、实验原理

首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。

仪器与试剂

1、琼脂糖凝胶电泳系统

2、紫外观察分析仪

3、离心机

4、单面刀片

5、恒温水浴锅

注意事项：

切胶时应快速操作，在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛；

溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波

长紫外灯，切胶时间尽量短。

胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。

把洗脱液加热，使用时有利于提高洗脱液效率。

回收产物质量： 回收产物的质量主要指纯度。 常规电泳过程中， 普通级别的琼脂糖自带的一些性状不明的多糖， 会连同 DNA 一起从凝胶中抽提出来， 会强烈抑制后继的连接、 酶切、 或者标记、 扩增等实验。 从凝胶中回收 DNA 片断， 产物的纯度自然是我们考虑的第一要务。 对于大片断 DNA 回收， 质量还包括了产物的完整与否， 如果机械剪切力使得回收产物大小不一致， 后果决不是你希望碰见的。 而对于较小片断回收，质量其实还包括了回收产物的浓度。因为产物浓度太小，对后继实验同样也有影响，比如连接、 标记实验等等就很不爽，往往不得不再浓缩一次， 增加了操作的复杂性。此外，极微量的纯化介质或者是某些试剂混入回收产物中也会对结果产生致命的影响。

回收率：回收得率，是我们考虑的另一个重要参数。 由于上电泳的样品量通常都很少， 电泳的过程本身也会导致样品的分散和损失， 因而尽可能多的回收电泳凝胶条带中的目的片断， 提高产物得率， 对于后继实验来说是非常重要的。 回收率的多少通常和回收产物的大小以及量的多少有关， 比如 DNA 片断越大， 和固相基质的结合力越强， 就越难洗脱， 回收率就低； 又比如说， DNA 的量越少， 相对损失越大， 回收率越低。因此， 根据情况选择不同的方法是很重要的。 值得注意的是， 由于样品的大小和多少对回收率都有显著的影响， 所以回收率并非是一成不变的。 虽然是几乎不需要实验技巧的简单操作，如果你注意到一些小技巧 还是很有帮助的。 DNA 回收纯度取决于纯化介质对 DNA 吸附的特异性、洗涤杂质是否彻底。而 DNA 回收率和浓度则与 elution buffer 的体积，以及 buffer

在柱子上停留的时间有关。 较大的洗脱体积可以提高回收率， 充分洗脱， 但是会造成产物浓度太低不好用。

一、实验原理

大肠杆菌经过处理后可以摄取外源 DNA（Plasmid DNA、 Phage DNA 等）， 处于这种状态的细胞称为感受态细胞（Competent Cell）。在基因工程实验中，经常要使用各种感受态细胞进行 DNA 的转化操作。实验使用的感受态细胞的来源大体可以分为两种： 一种是购买商品化的感受态细胞， 但商品化感受态细胞成本高、 运输及保存有一定困难（超低温）；另一种是自己制备感受态细胞，实验人员自己制作感受态细胞时，往往受到各种试剂及实验条件等限制，制备的感受态细胞效率低，达不到实验要求。目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。在一定条件下，经过连接后的DNA片段与感受态细胞混合保温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。

二、实验所需器材和试剂

器材：恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱， 恒温水浴锅， 制冰机， 分光光度计，微量移液枪。

试剂：

1.LB固体和液体培养基。

2.含特定抗生素的LB固体培养基。

3.100mM CaCl2溶液。

4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水，分析纯)，溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。

5. 待转化质粒。

四、实验注意事项

1. 制作感受态细胞时应使用专用的玻璃器皿或塑料容器。洗刷这些玻璃器皿或塑料容器时应尽量洗净。由于微量的洗涤剂或污染物都可能降低感受态细胞的转化效率， 因此在洗刷完用于制作感受态细胞的专用玻璃器皿或塑料容器后，最好用去离子水浸泡一晚，然后再充分洗净。

2. 制作感受态细胞时使用的菌种，不应使用4℃或常温保存的传代细菌。 应使用-70℃保存的菌种，在LB/抗生素平板培养基上分级划线培养后， 挑取单菌落。 使用这种菌种制作的感受态细胞， 能提高转化效率。

3. 培养感受态细胞制备用菌体时， OD 600值的测定应随时进行， 以使 OD 600 值控制在0.35～0.5之间。如果 OD 600值超出此范围，可能降低感受态细胞的转化效率。

4. 用于感受态细胞制备的菌体培养停止后要立即处理， 不要将培养液过长时间室温放置，在冰中放置时也不要时间过长。

5. 感受态细胞的制备操作过程中，离心后弃上清时要尽量弃尽，否则会降低感受态细胞的转化效率。

6. 使用 Solution A、Solution B 悬浮沉淀时要用手指轻轻弹动 Microtube 管壁，禁止剧烈震荡操作。

7. 为了有效确认感受态细胞的转化效率， 最好制作一批高纯度的质粒 DNA 分装低温（-20℃）保存， 用作阳性对照，以确认每批制作的感受态细胞的转化效率。

感受态细胞的制备方法

1. 菌种纯化

① 使用LB/抗生素平板培养基（根据菌种性质加入适当的抗生素），用接种针挑取大肠杆菌（-70℃甘油保存菌），在平板培养基上分级划线，以能够出现单菌落为宜。

② 将上述划线的平板培养基倒置于恒温培养箱中 37℃过夜培养。

2. 菌体培养

① 取20 ml φb×broth移至100 ml三角烧瓶中，塞上棉塞后高温高压灭菌，然后冷却至室温。 ② 在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到①的培养基中。

③ 37℃振荡（约 120 rpm）培养。

④ 测定OD 600值，当 OD 600 值达到0.35～0.5时（约培养5小时）放置冰中停止培养（如果 OD 600值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率）。

⑤ 进行下一步操作。

3. 感受态细胞的制备

① 取上述菌体培养液 1 ml 于 1.5 ml Microtube 中（根据需要量确定 Microtube 数量） ② 1，500×g（一般的微型离心机约 4，000 rpm）4℃离心 5 分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）

③ 在每个 Microtube 中加入 100 µl 冰中预冷的 Solution A， 轻轻弹动 Microtube 使沉淀悬浮， 禁止剧烈振荡

④ 1，500×g（一般的微型离心机约 4，000 rpm）4℃离心 5 分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）

⑤ 在每个 Microtube 中加入 100 µl 冰中预冷的 Solution B， 轻轻弹动 Microtube 使沉淀悬浮， 禁止剧烈振荡

⑥ 感受态细胞制作完成。本感受态细胞可以直接用于 DNA 的转化实验，也可以于-80℃中保存，以备以后使用。在-80℃保存时，可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦融解后，不能再进行-80℃保存

感受态细胞的 DNA 转化

1. 将-80℃保存的感受态细胞置于冰中融化 10 分钟。

2. 取 100 µl 的感受态细胞移至新的转化管中。

3. 向感受态细胞中加入 0.1 ng～10 ng（3 µl～10 µl）的转化用 DNA， 轻轻混匀后冰中放置 30 分钟。

4. 42℃水浴中放置 45 秒钟后，立即于冰中放置 1～2 分钟。

5. 加入 890 µl 37℃预温的 SOC 培养基。

6. 37℃振荡培养 1 小时。

7. 取适量涂平板后，将平板倒置于 37℃培养箱中培养一夜。

8. 确认培养菌落，进行下步实验。

为了提高转化效率， 实验中要考虑以下几个重要因素：

1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时

为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。

2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。

3. 试剂的质量: 所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。

4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。