免疫荧光法-冰冻切片
05-05
免疫荧光－冰冻切片间接法
免疫荧光法实验——冰冻切片
间接法
【标本】正常肝、肝癌标本冰冻切片
【抗体和试剂】
（1） 荧光标记抗体：兔抗人LAPTM-4B-N端（胞浆内）一抗；羊抗兔
IgG-TRITC二抗；小鼠抗人integrin 6 McAb；小鼠抗人EGFR多抗（小鼠抗人EGFR单抗）；羊抗鼠IgG-FITC二抗（工作浓度为1:30）；
（2） 0.01mol/L pH7.4 PBS
（3） 2%BSA：用于配制一抗及封闭非特异性结合位点（可用正常羊血清
封闭非特异性结合位点）
（4） 缓冲甘油封片：1份0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液与9份甘油混合
0.2mol/L PB：X ml 0.2mol/L Na2HPO4 + Y ml 0.2mol/L NaH2PO4
pH8.0 X=94.7ml; Y=5.3ml
【染色步骤】
1． 冰冻切片室温丙酮（冷丙酮）固定10min，PBS洗5min×3；
2． 2％BSA37C封闭60min或4C过夜；
3． 置切片于湿盒内，分别滴加一抗37C 30min；
4． PBS洗5min×3；
5． 分别滴加二抗37C 30min；
6． PBS洗5min×3；
7． 若染核；用1g/ml Hoechst33342染色10min；PBS洗5min×3；
8． 缓冲甘油封片；
9． 荧光显微镜下观察或-20℃避光保存；