产淀粉酶菌株的分离和筛选

产淀粉酶菌株的分离及筛选

摘要：【实验目的】 1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。 2了解产淀粉酶菌株的分离方法。 3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。 【实验原理】 淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂.。

【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。 2了解产淀粉酶菌株的分离方法。

3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。

【实验原理】

淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程均有重要价值，如添加高温淀粉酶可提高啤酒质量，中温蒸煮条件下添加适当耐高温a-淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精质量，同时可提高设备利用率等。淀粉酶在面包焙烤过程中分解淀粉产生的可溶性糖被酵母转化成酒精和CO2气体，不仅能增加面包体积，同时还有改善面包表皮色泽、提高面包软度、延长保质期的作用，对面包冷却和冷冻也有重要作用。由于微生物数量多，繁殖快，工业生产主要采用向生物发酵法大量生产该制剂。

本实验从土壤中分离的淀粉酶产生菌从温度、pH值两方面探讨其产酶的最适条件。通过平板培养法，从样品中初步分离出淀粉产生菌株，再通过单菌落培养从而获得比较纯的菌种。然后对其进行二级扩大培养，最终测定液体培养基菌液中被酶分解得到的葡萄糖含量来讨论菌株的最适条件（温度、pH值等），为工业街道淀粉酶及饲料添加剂提供候选菌株。

【仪器、材料和试剂】 （一）仪器 1、恒温培养箱 2、高压蒸气灭菌锅 3、摇床

4、恒温水浴锅 5、生物显微镜 6、电子天平 （二）材料

样品一：存放过久发霉的麦芽和周围粉尘 样品二：米饭生产线附近草坪上的土壤 （三）试剂与器材

1、锥形瓶（50ml、100ml、500ml等） 2、培养皿（25个左右） 3、大小试管（30个左右）

4、移液枪（1000μl、100μl）及大小枪头若干 5、酒精灯、接种针等 6、牛肉膏或酵母膏 7、蛋白胨 8、NaCl 9、可溶性淀粉

10、琼脂 11、卢戈氏碘液 11、草酸铵结晶紫 12、碘液 13、95%酒精 14、蕃红染色液 15、蒽胴试剂（现配）

16、葡萄糖标准液(0.1 g/L)

实验环节1 产淀粉酶菌株的初筛

【实验步骤】

1、称取一个样品5g，倒入盛有45mL无菌水带塞的三角锥形瓶中，摇床振荡30min制成样品悬液记为10-1土壤稀释液；

2、用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中吹吸数次混匀即为10-2稀释液，照此方法分别制成10-2~10-9稀释液；

3、分别取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9土壤稀释液各0.5mL，涂布于平板培养基表面，一个稀释度涂布接种2块平板，37℃下恒温培养16h ；

4、待长出菌落后滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，作为初筛菌株。

实验环节2 产淀粉酶菌株的复筛

【实验步骤】

1、把初筛出的菌株划线到平板培养基上（每株2份），37℃下恒温培养16h，长出单菌落后，选择直径约为几㎜的单菌落，滴加卢戈氏碘液，用直尺测水解圈直径，选取水解圈直径相对较大（水解圈直径/单菌落直径）的菌株作为复筛菌株即实验菌株。

2、细菌初步鉴定之形态观察：菌落观察。

观察实验菌株生成的不同菌落的形态特点。观察内容主要有大小、形状、表面、质地和颜色等方面。其中，颜色观察需先进行革兰氏染色。

3、革兰氏染色：革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法如下：

(1)菌液涂片固定

(2)草酸铵结晶紫染1分钟 (3)自来水冲洗

(4)加碘液覆盖涂面媒染1分钟 (5)水洗，用吸水纸吸去水分

(6)加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分 (7)蕃红染色液染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。

染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。并用枯草芽孢杆菌染色作对比。

表3 对6、7、9号菌株革兰氏染色

4、扩大培养

为使菌株培养效果更好，获得充分的培养物作为产酶条件优化的材料，对6、7、9号菌株进行两次放大培养。第一次放大培养，用接种针把菌株接种到装有50mL淀粉液体培养基的锥形瓶中，摇床培养16h。 5、产酶条件优化

(1)第二次放大培养，分别用配制的pH值梯度为6.0、7.0、8.0、9.0、10的淀粉固体培养基，及28℃、33℃、37℃温度条件下进行恒温培养24h；

(2)用蒽酮试剂法，通过对比葡萄糖标准液（0.1g/L）的吸光度值，测出各条件下培养后菌液的糖含量；菌液各取0.1ml稀释100倍，再进行测试。

(3)绘制pH值梯度和温度梯度下的吸光度曲线，研究该菌株产酶的最适温度和最适pH值。

【实验结果】

产酶条件优化最终选取实验菌种6号和7号进行糖度测定，菌液浓度稀释了100倍。 表4 温度对菌种产酶活性的影响

表5 pH值对菌种产酶活性的影响