组合化学与多肽合成_马宇辉

DOI:10.14081/j.cnki.hgdxb.2004.01.016

2004年2月

第33卷第1期河北工业大学学报February 2004V ol.33No.1JOURNAL OF HEBEI UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

文章编号：1007-2373(2004) 01-0055-06

组合化学与多肽合成

马宇辉，赵静波，赵继全，郑辉杰

（河北工业大学

化工学院，天津300130）

摘要：介绍了组合化学产生的背景和组合化学的定义以及组合库的构建和鉴别方法，并就其在

多肽合成方面的应用述以实例，最后对其发展方向作一展望．

关键词：组合化学；快速筛选；多肽库；功能多肽；多肽合成

中图分类号：O621.3文献标识码：A

组合化学的基本理论

所谓组合化学[1]，就是将诸如氨基酸、核苷酸、有机小分子类的构建单元按某种组合方式连接起来，合成出包含大量化合物的化学库，并从中筛选出具有某种物理、化学或药理活性化合物的一套合成策略和筛选方案．仅仅几年时间，组合化学就发展成具有如下研究新内容的交叉学科：1）随机肽，蛋白及非天然聚合体化学库；2）寡糖及寡糖核苷酸库；3）小分子有机化合物库；4）化学库的设计、构建及自动化合成；5）分子标记、分子骨架和构件单元试剂盒；6）快速及计算机筛选；7）化合物库数据处理及软件工具；8）群集筛选方法的研究；9）组合化学技术工业．

组合化学研究的3个基本阶段为：1）分子多样性化学库的合成（包括设计模板分子、研究和优化组合合成方法、选择构建单元、规定化学库的容量，保证化学库的再生，寻求化学库的质量监控方法及优化条件，完成自动化合成等）；2）群集筛选（设定液相或固相筛选方法，即合成产物是挂在树脂上还是切落于溶液中进行筛选．选择筛选模型，包括细胞功能性筛选，受体、抗体，基因表达蛋白筛选，采用的指示方法如染料染色、荧光标记、同位素标记以及自动化筛选等）；3）化学库解析，译码（即确认活性分子结构，有Houghten 的逐位和二元定位理论、亲和选择法、检索库法、编码化学库等）．收稿日期：2003-07-02

作者简介：马宇辉（1978-），女（汉族），硕士生．

56河北工业大学学报2004年第1

期

个单元与另一组

+

个构建单元，产生

×个化合物，如图1．

以肽类化合物为例，用20种天然氨基酸为构建单元，二肽便有400（202）种组合，三肽有8000（203）种组合．以此类推，到8肽将有[1**********]（208）种组合．常见的组合库构建方法有混合—均分法（一株一肽），迭代展开法，位置扫描法，光控定位合成法，茶叶袋法等等，现在就多肽合成为例

列举几种组合库的构建方法．

迭代法

用迭代法处理含两个单元的8个三聚物时，先合成两个子库A 1-X-X 和A 2-X-X ，选择A 1和A 2

中哪一

组合化学与多肽合成57个性能更优．假设确定A 1，再固定位置1，合成两个子库A 1-B 1-X 和A 1-B 2-X ，检验性能后，假设确定B 2，再合成两个子库A 1-B 2-C 1和A 1-B 2-C 2．最后筛选得到最佳产物A 1-B 2-C 1．因此，含8个三聚物的库，需进行3×2个展开步骤，对于含204（160000）个四肽的库，需展开4×20个步骤，如图3所示．

位置扫描法与迭代法相类似，不同的是，该法从合成产生，即将库分成若干子库，如合成三元混合物，需要制备6个子库，使得每个构建单元占据3个位置中的1个，同时检验6个库中各成员的性能，以确定在每个位置中，哪一个单元活性最高，如图4

所示．

茶袋法（

58河北工业大学学报2004年第1

期

）

聚乙烯针状小棒为固相载体，先在小棒一端接上联肽结构，另一端则固定于板上，每块板可固定几十支平行排列的小棒，注意排列要规则，两针间距离适宜．反应时将此板小棒头浸于相对应滴度槽中进行缩合反应，整个过程采用Merrifield 标准合成方法完成，最后脱去保护基，但不从载体上切下肽链，

让肽段悬挂于树脂上可多次重复的进行活性研究．

目标产品的筛选

组合化学被称为“多样性的科学”．如何鉴别具有大量混合的组合库，并对库化合物进行分析和表征，一直是制约组合化学发展重要因素，目前库的分析和表征方法以质谱法[2]为主，包括电子喷雾离

[3]子MS ，电子喷雾离子Fourie 变换MS ，基体辅助的激光解吸/电子飞行时间MS 等技术的运用，可对

固相表面进行非破坏性分析，得到详尽的库信息，以探测库的多样性和复杂性．与其它技术连用，如HPLC/MS，键合相毛细管电泳/MS和MS/MS等方法，可对固相库和液相库的多个成分进行分析和表征．

大数目和微量制备测试样品是快速筛选技术的关键．以Selectide 技术为例，固相筛选主要是依据分子水平的筛选模式，将所合成的固载化学库分子直接与活性蛋白反应，再用蛋白染色或标记的方法将活性株挑选出来进行结构确认．例如，抗原—抗体反应[4~6]，蛋白G 、MHC-类分子的筛选，凝血酶、因子Xa 活性抑制研究，抗菌素受体配基筛选和胰蛋白酶功能研究等，它的特点是：快速，仅数小时即可筛选107~108树脂球（每一个树脂球上负载一个化合物，或负载多个化合物）．液相筛选是指将合成的分子从树脂载体上切入溶液中进行生物筛选，目前主要采用Houguten 的逐位或二元定位方法和化学库编码方法进行．

也可利用自动连续柱色谱法，对肽库进行筛选．将含固定化目标分子的“目标”柱与色谱反相柱相连，肽库中的化合物先入目标库，由于它们和目标分子的相对键合性不同，专一性键合的肽从反相柱流出后，被鉴定和测序．此法使筛选速度大为加快．

生物活性筛选采用反应株—肽—抗体复合物被第二个带荧光抗体或酶标记，显微镜下对呈阳性的柱与未被染色的非活性柱进行分检，在经Edman 降解测定该株上肽的顺序，另一种活检方法是每步合成中，缩合一个氨基酸同时接上一个结构相关并且光照能释放，可用GC 分离鉴定的标记分子，反映完成后与染色受体作用，分离出染色的反应株，用光游离标记物，GC-EI

法鉴定每个株上标记物组成．

茶袋法合成六肽库

Houghten 用茶袋法合成了一个六肽库，该库由18个分库组成，每个分库又由18组混合肽组成．这样每组的前两个氨基酸是确定的，即分别为18个2-氨基酸中的一个，表示为AC-O 1O 2XXXX-NH 2，每组共含有204个肽片，通过ELISA 监测找到活性最高的一组肽片然后即可建立AC-O 1O 123XXX 肽库，找出活性高于平均值的一组，以确立第三个氨基酸O 3，依次为下一轮合成与筛选的目标，如此进行4、5次

组合化学与多肽合成59选代筛选，即可确定活性最高的肽片的氨基酸组成[7]．此法配合电脑“分检”可进一步提高操作效率，合成中还可将D-型氨基酸组合进肽链，以提供足够量供药理筛选的自由肽[8]．应用表明，茶袋法对抗

原决定簇分析，肽激素分子研究，蛋白质片段构想描述具有重要意义．

ｍｏｌ／ｃｍ2的取代密度与纤维表面-OH 相连，多

余-OH 用AC 2O-封闭．将第一个氨基酸先接到纸片上，然后用机械手吸管均匀吸保护氨基酸活化酯于相隔1cm 氨基点上进行缩合反应（共布49点），完成缩合后，再将纸浸泡于溶液中洗涤，乙酰化，脱保护，最后用乙醇洗涤，干燥纸片，如此循环直到接肽完成，去保护后直接进行ELISA 活性分析，剪下具有活性的点或采用柱法，将100个纸片紧排于玻璃柱内，每柱载不同的保护氨基，然后进行常规Merrifield 操作，即得较大量的活性肽段，Frank 用此完成了巨噬细胞病毒（cytmegalovirus ，hcnv ）免疫区域抗原决定族的分析[9]

．

-细胞淋巴瘤特异肽库等[10]．3天内就完成247万多个肽产物的制备，

每粒树株脂带有50~200pmol 的一种肽，进行活性监测时先将受体与碱性磷酸酯或荧光试剂偶联，再与肽库培养．半天内就可以挑出着色的或显荧光（即有活性）的珠子进行氨基酸顺序分析，定出先导物的结构．结果发现YGGFQ 、YGGFA 及YGGFT3种肽与抗

抑制纤维生成的抗蛋白水解酶的配体合成

Lars 从D-型氨基酸五肽库中筛选出可以抑制A

-肽（A

沉淀是研究的关键．Lars 等人用纤维载

体法[12]合成了五肽库，用活化的Fmoc -丙氨基酸二肽的垫片偶联到衍生化的纤维膜上，然后用溶解在N-甲基吡咯丙酮中的Fmoc-保护和五氟苯基活化的氨基酸进行反应合成所需的肽（偶联效率用溴酸兰检测）．一个五肽组合化学库理论上应包括所有的2476099种肽（不包括半胱氨酸的19种D-氨基酸的组合）用碘标记法筛选出130321种不同序列．这些氨基酸中有的碱性侧链（h ，k ，r ），有的有芳香侧链（f ，y ，w ），有的有非极性侧链，带有酸性侧链的氨基酸不能提高结合力，这说明了电子相互作用（即与LBMP1620的Lys 相互作用）对结合并不重要．最后发现KLVFF 可与A 16-20立体特异性结合，分子模型表明，两种结构相似的序列靠Lys 、Leu

和苯丙氨酸的羧基相互作用形成非典型的反平行

结合，而且可以阻止淀粉样纤维生成．

60河北工业大学学报2004年第1期多肽组合化学技术用于建立各类肽库分子库从80年代中期的探索至90年代才起步．其定性的报道也是近几年的事．然而它却为快速大量合成生物活性肽类化合物提供了全新的思路．因此，很快成为多肽类新药研究开发中的热点．

组合化学具有巨大的发展潜力，随着其在更多化学领域中的渗透，组合化学将会得到更大的发展．参考文献：

[1]刘东祥，蒋华良，陈凯先，等．化学库及分子差异性设计研究进展[J ]．化学通报，1998（2）：34-36．

[2]Brummel C L ，Lee I N W ，Zhou Y ，

264：399-402．

[3]Dunayevskiy Y ，Vouros P ．Characterization of the complexity of small-molecule libraries of electrospray ionization mass spectrometry [J ]．Anal Chem ，1995，67：2906-2921．

[4]Kassarjian A ，Schellenberger V ，Turck C W ．Screening of synthetic peptide libraries with radiolabeled acceptor molecules [J ]．Peptide Res ，1993，

（6）：129-133．

[5]Needels M C ，Jones D G ，Tate E H ，

Sci ，1993，90：10700-10704．

[6]Ohlmeyer M H ，Swanson R N ，Dillard L W ，

1993，90：10922-10926．

[7]Houghten R A ，Pinilla C ，Blondelle SE ，

[J ]．Nature ，1991，354：84-86．

[8]Wang J X ，Brag A M ，Di Pasquale A J ，

[9]Frank R ，Guler S ，Krause S ，．Application of the multipin peptide synthesis technique for peptide receptor binding studies ：Substance P as a modle system [J ]．Bioorg Med Chem Lett ，1993（3）：447-451．．The SPOT-synthesis technique Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications [J ]．Int J Peptite Protien Res ，2001，267(1) ：13-26．

[10]Lam K S ．Troabment of B-cell lymphoma using peptide a novel concept [J ]．The Western J Medicine ，1993，90：11708-11720．

[11]Frank R ．An easy technique for the pasitionglly addressable ，parallel chemical synthesis on a membrane support [J ]．Tetrahedron ，1992，48：9217-9236．

[12]Lars O ．Tjernberg Solid-phase synthesis of bis-heterocyclic compounds from resin-bound orthogonally protected lysine [J ]．J Biol Chem ，1997，271：8545-8593．．Generation and use of synthetic peptide combinatorial librayies for basic research and drug discovery ．Complex synthetic chemical libraries indexed with molecular tags [J ]．Proc Natl Acad Sci ，．Generation and screening of an oligonucleotide-encoded synthetic peptide library [J ]．Proc Natl Acad ．A mass spectrometric solution to the address problem of combinatorial libraries [J ]．Sciense ，1994，

Combinatorial Chemistry and Peptides Synthesis

MA Yu-hui ，ZHAO Jing-bo ，ZHAO Ji-quan ，ZHENG Hui-jie

(School of Chemical and Engineering, Hebei University of Technology, Tianjin 300130, China

)

：The article introduces the background and definition of the combinatorial chemistry, the design and dis-crimination of the combinatorial libraries. Some samples about the applications on peptides synthesis are given and the future of combinatorial chemistry are discussed in this

perspective.

：combinatorial chemistry ；high throughput screening ；peptides libraries ；functional peptides ；peptides synthesis