蛋白质浓度测定(微量凯氏定氮法)
姓名 *** 学号*** 系年级 11级生物基地 组别 ** 同组者 ***
科目细胞生物学实验 题目 蛋白质浓度测定（微量凯氏定氮法） 日期 2013.06.03
蛋白质浓度测定（微量凯氏定氮法）
【实验目的】
1.掌握凯氏（Kjeldahl）定氮法测定蛋白质含量的基本原理和方法。
2.学会使用凯氏定氮仪。掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸 馏、滴定及蛋白质含量计算等。
【实验原理】
蛋白质是含氮的化合物。凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，硫酸铜起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧化氢作为氧化剂以加速有机物氧化。消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接收瓶内，硼酸接收氨后，形成四硼酸铵，然后用盐酸标准溶液滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。以甘氨酸为例，其反应式如下：
NH2CH2COOH+3H2SO4 →2C02+3SO2+4H2O+NH3 （1） 2NH3 +H2SO4 →(NH4)2SO4 （2）
(NH4)2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3 ↑ （3）
反应（1），（2）在凯氏烧瓶内完成，反应（3）凯氏蒸馏装置中进行（如图
1）。 蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量（约在14％~18％，平均为16％）。凯氏定氮法测定出的含氮量，再乘以系数6.25，即为蛋白质含量。
【实验材料】
1.试剂：牛奶；浓硫酸；CuSO4催化剂；标准品(NH4)2SO4（N的浓度为0.3mg/ml）； 2％硼酸；0.01167mol/ml Hcl（已标定）；30％NaOH；甲基红指示剂。
2.器材：
图1 微量凯氏定氮装置 图2 酸式滴定管
1.电炉；2.蒸汽发生装置（2L圆底烧瓶）；3.螺旋夹；4.小漏斗及棒状玻璃塞；
5.反应室；6.反应室外层；7.橡皮管及螺旋夹；8.冷凝管；9.蒸馏液接收瓶 此外还有10.100ml三角瓶（3个以上）；11.2ml移液管、5ml移液管；12.洗耳球；
13.大烧杯；14.吸管；15沸石；16.洗瓶；17.凯氏烧瓶；100ml容量瓶
【实验步骤】
1.样品消化
量取牛奶样品2ml于干燥的凯氏烧瓶中，加入3ml浓硫酸和200mg催化剂，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化。开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，当消化液呈淡黄色时，冷却，加入2滴H2O2，继续加热0.5h，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，取出冷却，冷却后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。
试剂空白：向凯氏烧瓶内加入1ml蒸馏水，加入与样品消化相同的浓硫酸和催化剂，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。
2.仪器洗涤
在蒸气发生瓶内装如约三分之二的自来水，加甲基红指示剂数滴，再加入数毫升硫酸，直至溶液呈粉红色，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）防止暴沸。测定前定氮装置如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子3，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子7由橡皮管排出，如此数次。 用蒸汽洗涤反应室约10min后，在冷凝管末端小玻璃管的位置放上一个盛硼酸-指示剂混合液的锥形瓶，将瓶倾斜，以保证冷凝管末端连接的小玻璃管完全浸于液体内。继续蒸馏1~2min。观察锥形瓶内溶液是否变色，如不变色，则证
明反应室内部已洗涤干净；如果混合液变绿，说明定氮仪内有残留氨，没有洗涤干净，需要进一步用蒸汽洗涤。
3.标准(NH4)2SO4滴定练习
（1）空白的滴定
仪器洗涤好后，取一100ml锥形瓶，加入5ml硼酸溶液，并使冷凝管下端玻璃管插入硼酸溶液中。取下4（图1）棒状玻璃塞，利用2ml移液管准确向反应室加入2ml蒸馏水，然后将玻璃塞放回，再加入10ml30%NaOH溶液，加入少许蒸馏水，冲洗30%NaOH溶液，然后将玻璃塞放回，并留少量液体作水封。如果锥形瓶内的硼酸溶液由紫红色变为鲜绿色，从变色开始计时蒸馏3min,然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，继续蒸馏1min，并用少量蒸馏水洗涤冷凝口外围，移去锥形瓶，立即用标准盐酸溶液进行滴定，当硼酸溶液变为浅粉红色时，停止滴定，记下消耗的Hcl体积。如果硼酸不变色，不需要进行滴定，空白管消耗Hcl体积记为0。
（2）标准(NH4)2SO4滴定
用蒸馏水洗涤仪器2~3次之后，另取一100ml锥形瓶，加入5ml硼酸溶液，并使冷凝管下端玻璃管插入硼酸溶液中。取下4（图1）棒状玻璃塞，利用2ml移液管准确向反应室加入2ml标准(NH4)2SO4溶液，然后将玻璃塞放回，加入少许蒸馏水，冲洗标准(NH4)2SO4溶液，然后将玻璃塞放回，再加入10ml30%NaOH溶液，再加入少许蒸馏水，冲洗30%NaOH溶液，然后将玻璃塞放回，并留少量液体作水封。等到锥形瓶内的硼酸溶液由紫红色变为鲜绿色后开始计时，继续蒸馏3min,然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，继续蒸馏1min。并用少量蒸馏水洗涤冷凝口外围，移去锥形瓶。立即用标准盐酸溶液进行滴定。平行三次。 如果用滴定结果计算出的标准硫酸铵中氮含量接近于0.3mg/ml。则说明整个实验操作正确，可以进行下一步。
4.样品滴定
（1）试剂空白消化液的滴定
滴定过程与用标准(NH4)2SO4滴定练习中空白的滴定相同，只不过是将2ml蒸馏水替换为2ml消化后的空白对照溶液。同样，如果锥形瓶内的硼酸溶液由紫红色变为鲜绿色，从变色开始计时蒸馏3min,然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，继续蒸馏1min，并用少量蒸馏水洗涤冷凝口外围，移去锥形瓶，立即用标准盐酸溶液进行滴定，当硼酸溶液变为浅粉红色时，停止滴定，记下消耗的Hcl体积。如果硼酸不变色，不需要进行滴定，空白管消耗Hcl体积记为0。
（2）样品的滴定
滴定过程与用标准(NH4)2SO4滴定练习相同，只不过是将2ml标准(NH4)2SO4溶液替换为2ml消化好的样品溶液。同样，等到锥形瓶内的硼酸溶液由紫红色变为鲜绿色后开始计时，继续蒸馏3min,然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，继续蒸馏1min。并用少量蒸馏水洗涤冷凝口外围，移去锥形瓶。立即用标
准盐酸溶液进行滴定。平行三次。 【实验结果】
式中 m:样品含氮的质量，即100ml样品中含氮量（mg）；
A：滴定样品消耗的HCl溶液体积（ml）；
B：滴定空白消耗的HCl溶液体积（ml）；
V：相当于未稀释样品的体积（ml）；
C：盐酸物质的量浓度（mol/L）；
14.008：每摩尔氮原子质量（g/mol）；
100：100ml样品。
经计算：
①(NH4)2SO4溶液中N的浓度=0.01167×3.675×14.008×1000/2=0.3004mg/ml，与标准(NH4)2SO4中N的浓度（0.3mg/ml）相差不大。
②稀释定容过的样品中N的浓度=0.01167×1.152×14.008/2=0.09416mg/ml； 每100ml牛奶样品中含蛋白质的质量=0.09416×100×6.25×100/2/1000= 2.9425mg
【注意事项】
1. 样品应是均匀的，液体样品应振摇或搅拌均匀。
2. 消化要在通风橱内进行，消化时要把附在管壁上的食物用硫酸冲下，使消化 完全。
3. 消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。 若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后， 再继续加热消化至完全。
4. 在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底 部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。
5. 消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫 喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。
6. 定氮仪各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管绝对不能漏气。蒸馏时需控制火 力以避免样液倒吸。
7. 蒸气发生瓶内的水装至2/3 体积并且保持酸性（在蒸气发生瓶内的水中加入 稀硫酸，使之呈酸性，内加甲基橙指示剂数滴，水应呈橙红色，如变黄时，应 该补加酸），以防止在碱性条件水中游离氨蒸出，使结果偏大。
8. 蒸馏时，加入的氢氧化钠溶液除与硫酸铵作用外，还与消化液中的硫酸和硫 酸铜作用。若加入的氢氧化钠不够，则溶液呈蓝色，不生成褐色的氢氧化铜沉 淀。所以，加入的氢氧化 钠必须过量，并且动作还要迅速，以防止氨的流失。
9. 因蒸馏时反应至外层的气压大于反应室内的压力，而反应室的压力大于大气 压力，故可将氨带出。所以，蒸馏时，蒸气要均匀、充足，蒸馏中不得停火断 气，否则，会发生倒吸。
10. 两次蒸馏之间要洗涤仪器，洗涤仪器时，首先要关闭电炉电源，以防止，当 3处夹子夹紧时，蒸馏烧瓶内压强迅速升高，内部液体从上部喷出，对实验人 员造成伤害。
11.停止蒸馏时，由于反应室外层的压力突然降低，可使液体倒吸入反应室外层， 所以，操作时，应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸1min 后关掉热 源。