实验实训九 微生物接种技术
实验实训九 微生物接种技术
一、 实验实训目的
学习微生物工作的基本接种方法，建立纯培养技术中的“无菌“概念”，掌握无菌操作技术。
二、 实验实训材料
1．菌种 葡萄球菌、大肠杆菌斜面菌种。
2．器材 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（斜面、液体、柱状、平板等），接种环（针），酒精灯，酒精棉球。
三、 实验实训内容及方法
（一） 常用的几种工具（实图9-1）。
（二） 无菌操作
菌种分离或移接工作应在无菌环境中进行，接种室、接种箱或超净工作台是常用的接种环境。用前先清洁好卫生，再进行消毒处理。可用紫外线灯和甲醛熏蒸的双重作用，或用3%来苏尔及其他表面消毒进行喷雾。
操作者的手应先用肥皂洗净，再用酒精棉球消毒；整个操作过程都要靠近酒精灯火焰；接种工具在用前和用后必须在灯焰上灭菌；棉塞不得乱放，操作中只能夹在手上；不能有跑、跳等力度大的动作，以免引起空气大振动而增加染菌机会。
（三）接种方法
1．斜面接种法 把各种培养条件下的菌种，接入斜面上（包括从试管斜面、培养基平板、液体纯培养物等中把菌种移接于斜面培养基上）。这是微生物学中最常用、最基本的技术之一。接种前，需在待接种试管上贴好标签，注明菌名及接种日期。接种最好在无菌室或无菌箱内进行，若无此条件，可在较清洁密闭的室内进行。室内应事先消毒，桌面要清洁，除去灰尘和杂物，用5%来苏儿溶液擦洗桌面。斜面菌种移接的基本操作方法及注意事项见实图（9-2）。
（1）点燃酒精灯，灯焰周围约1～2cm 处的空间为无菌区，所以在酒精灯灯焰旁进行无菌操作法接种，可避免杂菌污染。
（2）将菌种及接种用的斜面培养基（即两支斜面试管）同时握在左手中，使中指位于两试管之间。管内斜面向上，两试管管口相互平行，两支试管处于接近水平位置，用右手的小指、无名指及手掌在火焰旁同时拔去两支试管的棉塞，并使管口在火焰上通过，以烧死试管口的杂菌。随后把管口移至火焰近旁约1-2cm 处。
（3）右手拿接种环，先垂直、后水平方向把接种环放在火焰上灼烧。凡是需进入试管的杆部分均应通过火焰灼烧，下端的环心须烧红，以彻底灭菌。灼烧时，应把环放在酒精灯之外焰（氧化焰）上，因外焰温度高，易于烧红。
（4）将烧过的接种环伸入菌种管内，先使环接触斜面上端的培养基或试管壁，使接种环充分冷却，待培养基不再被接种环融化时，即可将接种环伸向斜面中部蘸取少量菌体，然后小心地将接种环从试管内抽出。注意不能让环接触管壁和管口。取出后，接种环不能通过火焰，在火焰旁抽出并迅速伸入新培养基斜面管内，在斜面下1/5处，由下至上轻轻划线。注意不要把培养基划破，也不要把菌沾在管壁上。此过程要迅速、准确完成。
（5）接种完毕，试管口必须迅速通过火焰灭菌，在火焰旁塞入棉塞。注意
不要使试管离开火焰去迎棉塞，以免进入带菌空气。操作中如不慎使棉塞着火，要迅速塞入试管内，由于缺氧火自然就会熄灭。若棉塞 外端仍然着火，也不要用嘴吹，迅速用手捏几下棉塞，即可熄灭。
（6）划线完毕，接种环要灼烧灭菌，才能放回原处，以免污染环境。放回接种环后，再进一步把试管的棉塞塞紧。置28℃下培养2-3d ，进观察
2．液体接种
液体接种是一种用移液管、滴管或接种环等工具将菌液移接到培养基中的方法。吸管不同于其它接种工具，不能灼烧，可预先对其进行烘烤法灭菌。
3．穿刺接种
穿刺接种常用于保藏菌种或细菌运动性的检查。一般适用于细菌、酵母菌的接种培养。用接种针沾取少许菌种，移入装有固体或半固体培养基的试管中，自培养基中心垂直刺入到底，然后按原来的穿刺线将针慢慢拔出。
四、 实验实训报告
记录几种接种操作的结果。
五、 思考题
1．何谓无菌操作？接种前应作哪些准备工作？
2．总结几种接种方法的要点及应注意的事项？