二苯乙烯苷对沙鼠脑缺血_再灌注损伤的保护作用及部分机制_王栋
二苯乙烯苷对沙鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用及部分机制
王
摘要
目的
111栋，陈晓宇，刘晓利，赵
122
欢，张腾腾，赵中原，白
璐
2
研究二苯乙烯苷（TSG）对沙鼠脑缺血/再灌注
采用改良法建立沙鼠
损伤的保护作用及部分机制。方法
购于浙江省实验动物中心，许可证号：SCXK（浙）2008-0034。1．2
药品与试剂TSG（C20H22O9，分子量：406，纯度＞98%）：购自中国药品生物制品检定所；依达拉奉注射液：吉林省博大制药有限责任公司，规格：30mg/20ml，批号：20090607；超氧化物歧化酶（SOD）、Px）测丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-定试剂盒购于南京建成生物工程有限公司；水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司，批号：T20050609。1．3
DMSR-Morris水迷宫：中国医学科
学院药物研究所研制；T56紫外分光光度计：上海精
主要仪器
脑缺血/再灌注模型。沙鼠随机分为6组，假手术组、模型对TSG大、3、1.5mg/kg），中、小剂量（6、阳性对照药依达照组、
拉奉注射组（3mg/kg）。7d后通过Morris水迷宫测定学习记忆功能；脑组织匀浆行超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽Px）活性和丙二醛（MDA）含量测定；免疫过氧化物酶（GSH-组化SABC法显示Nestin蛋白在脑组织中的表达。结果与假手术组相比，模型组游出时间和游泳距离明显延长，而TSG治疗组、依达拉奉对照组较模型组明显缩短（P＜0.05，P＜0.01）。与假手术组相比，模型组沙鼠脑组织中SOD活GSH-Px酶活力单位明显降低，MDA含量明显升高。TSG性、
（6、3mg/kg）可显著提高血清SOD活性和GSH-Px酶活力单3、1.5mg/kg）可明显降低MDA含量；TSG（6、3、位，TSG（6、
1.5mg/kg）Nestin蛋白的表达水平较模型组有明显增高。结论
TSG对脑缺血/再灌注损伤有明显的保护作用，其机
抑制体内脂质过氧化水平及促进神制可能与抗自由基损伤、经细胞的修复有关。关键词
二苯乙烯苷；脑缺血/再灌注；自由基；巢蛋白
R651．15；R338
中图分类号
192；TGL-16H高速密科学仪器有限公司产品；MDF-离心机：珠海黑马医学仪器有限公司产品；DIAX-900内切式组织匀浆机：德国Heidolph公司。
1．4方法1．4．1
动物分组及给药将实验沙土鼠随机分为
TSG大剂量（6mg/kg）、假手术组、模型对照组、中
文献标识码A文章编号1000－1492（2012）04－0379－04
脑缺血后血流的再灌注是神经功能恢复的基本
但同时也会产生大量的自由基从而加剧损伤。条件，
TSG）系二苯乙烯苷（tetrahydroxystilbeneglucoside，著名滋补中药何首乌中特有的水溶性生物活性成分，具有显著的抗氧化活性等多项生理功能，临床上但TSG治疗缺用来治疗缺血性脑疾病的药物繁多，
血性脑疾病的作用及机制鲜见报道。笔者就TSG对脑缺血再灌注损伤的药效及部分机制做一研究。11．1
材料实验动物
60～80g。清洁级，雄性沙土鼠，
剂量（3mg/kg）、小剂量（1.5mg/kg），阳性药对照
药依达拉奉注射液（3mg/kg）。给药体积为10ml/kg，实验前30min腹腔注射注射给药，双侧颈总动脉结扎再灌后给药一次，以后每天给药一次，连续7d。假手术组及模型组分别给予等量的生理盐水。1．4．2
［1－2］
，造模采用改良levine法于手术当日
腹腔注射10%的水合氯醛麻醉空腹给药后30min，
（同时给予10μg阿托品以减少术中腺体分泌），消
毒，颈正中切口，分离甲状腺及气管前肌肉，将双侧
静脉分离后，用动脉夹夹闭颈总动脉与迷走神经、
10min，小心撤去动脉夹实现再灌注。假手术组处理方法同上，但不夹闭动脉。
1．4．3Morris水迷宫训练及测定
术后6d对各组［3］
各组动物给药30沙鼠进行Morris水迷宫训练，
min后开始训练，维持空间环境无改变，前4d每只动物训练4次，入池位置为安全岛所对象限及所邻象限，于象限边1/2弧度处将动物头朝池壁轻轻入120s未找到安全岛者，水，将其引至安全岛，放置30s引导其记忆。第5天进行测试，收集不同组别沙土鼠游出时间及游泳距离。数据采集和处理均由图像自动监视和处理系统完成。测试完成后，脱臼
2011－12－31接收
基金项目：安徽省教育厅自然科学研究项目（编号：KJ2010A183）；安
“早期接触科研”训练计徽医科大学七年制临床医学专业ZQKY-51）划项目（编号：2010-2
2009级本硕，作者单位：安徽医科大学1组织胚胎教研室、合肥
230032
作者简介：王
栋，男，硕士研究生；
E-mail：陈晓宇，男，副教授，博士，硕士生导师，责任作者，cxyayd@yahoo．com．cn
处死沙土鼠取脑，称重，左半脑组织按照1∶9稀释
GSH-Px活性和MDA含量测定；右半脑匀浆行SOD、
行免疫组化检测Nestin表达水平。
1．4．4脑组织匀浆SOD、GSH-Px活性及MDA含量GSH-Px严格按照试剂盒操作步骤测定SOD、
活性和MDA含量。用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活测定
性，于550nm处，用分光光度计测吸光度。MDA的测定用硫代巴比妥酸（TBA）法，于532nm处，用分光光度计测吸光度。脑组织匀浆蛋白质含量测定均
Px活力测定采用GSH-Px采用考马斯亮蓝法。GSH-GSH-px活试剂盒，操作程序严格按照说明书进行，
力单位用μ/ml表示。1．4．5
Nestin免疫组化染色切片厚4μm，常规
脱蜡至水后，加入3%H2O237℃孵育20min以灭活内源性过氧化氢酶；放入0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液中行微波抗原修复7min；滴加3%H2O2去离子37℃恒温孵育10min；滴加正常山羊血清封闭水，
37℃恒温孵育30min，液，之后倾去A液，勿洗；滴
4℃过夜；滴加生物素化山羊抗兔IgG工作加一抗，
37℃恒温孵育30min；滴加辣根酶标记链霉卵蛋液，
37℃恒温孵育30min（以上各步，白工作液，除特别说明外均用PBS洗3min×3次）；DAB显色，苏木
精复染，脱水，透明，封片。用光学显微镜（×400）观察每个视野Nestin蛋白表达数目，每组选取10个视野取其均值作为本组代表值。
珋1．5统计学处理所有数据以x±s表示，应用SPSS13.0统计软件包对数据进行统计分析，组间
比较用单因素方差分析。22．1
结果
Morris水迷宫实验
与假手术组相比，沙土
2．2
TSG对沙鼠脑缺血再灌注损伤脑组织中
SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响与假手
术组相比，模型组沙鼠脑组织中SOD活性及GSH-MDA含量明显升高。TSGPx酶活力单位明显降低，
（6、3mg/kg）可显著提高血清SOD活性和GSH-Px
TSG（6、3、1.5mg/kg）组可明显降低酶活力单位，MDA含量。见表2。
表2剂量
TSG对沙鼠脑缺血再灌注损伤脑组织中
SOD（U/mgprot）
406．1±96．1172．3±67．0##
GSH-Px
MDA
珋SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响（x±s）
组别假手术模型依达拉奉
TSG
（mg/kg）－10－3631．5
9101099n
（酶活力单位）（nmol//mgprot）
97．1±21．33．72±0．9546．1±14．7##
8．71±2．72##4．69±1．63＊＊5．13±2．68＊＊6．76±2．34*
375．3±125．8＊＊66．8±21．3*303．8±162．1*
230．9±118．2
68．9±29．6*64．3±24．1
383．6±105．9＊＊70．2±16．8＊＊5．08±2．22＊＊
＊＊
P＜0.01。与假手术组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，
2．3TSG对沙鼠脑缺血再灌注损伤脑组织中Nes-
tin蛋白的表达水平的影响
假手术组罕见Nestin
蛋白阳性表达，与假手术组相比，模型组Nestin阳性细胞有微弱表达，主要存在于胞质，呈三角形或多边
TSG（6、3、1.5mg/kg）组的Nestin蛋白表达明显形，
2
。增加，见图1，
鼠脑缺血再灌注模型组游出时间和游泳距离明显延
3mg/kg）剂量组游出时间和游泳距离长，TSG（6、
均比模型组缩短，提示TSG能改善沙鼠缺血再灌注
损伤的学习记忆功能。见表1。
表1
组别
假手术组模型组依达拉奉TSG
TSG对沙鼠脑缺血再灌注损伤Morris珋±s）水迷宫实验的影响（x
剂量（mg/kg）
－－3631．5
##
n109101099游出时间（s）18．52±5．4642．29±4．35##29．41±3．75＊＊28．15±4．09＊＊36．57±4．92*37．85±5．34
*
游泳距离（cm）399．65±42．25785．69±68．05##524．26±56．23＊＊486．56±64．65＊＊573．36±88．52＊＊623．84±104．23P＜0.05，
＊＊
图1各组沙鼠脑组织中Nestin表达水平×400
与假手术组比较：0.01。
P＜0.01；与模型组比较：P＜
A：假手术组；B：模型组；C：依达拉奉组（3mg/kg）；D：TSG（6mg/kg）；E：TSG（3mg/kg）；F：TSG（1.5mg/kg）
的。
Px）能够通过特异谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-性催化还原性谷胱甘肽（GSH）对过氧化氢的还原反应，保护细胞膜结构和功能上的完整，广泛存在于机体内
［5］
。其活性降低提示机体抗氧化能力下降，
致使过氧化氢的堆积，攻击细胞膜引发脂质过氧化作用导致细胞损伤。本实验中，模型组较假手术组Px酶活力单位明显降低，TGS沙鼠脑组织中GSH-（6、3mg/kg）组可显著提高GSH-Px酶活力单位。
图2
0.01。
各视野中沙鼠Nestin阳性细胞计数
Px活性，提示TSG可通过提高GSH-减少过氧化氢从而达到保护缺血/再灌注状态下神经元功的堆积，
能和结构上完整的目的。
巢蛋白（Nestin）为在神经干细胞中特意表达的一类第Ⅳ类中间丝蛋白，定位于胞质，是鉴别神经干细胞的主要标志之一
［6］
＊＊
P＜与假手术组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，
3讨论
脑缺血/再灌注损伤所致的学习记忆能力下降
。近来发现，脑缺血缺氧等
是由于兴奋性氨基酸介导的钙超载、氧化应激损伤、线粒体功能障碍等多种因素共同作用，最终导致神经元尤其是海马区神经元的迟发性死亡。本实验采取改良levine法建立沙鼠缺血/再灌注损伤模型，术后6d对各组沙鼠进行Morris水迷宫训练并检测其学习记忆能力。结果显示：沙鼠脑缺血/再灌注模型组较假手术组游出时间和游泳距离明显延长，TSG3mg/kg剂量组游出时间和游泳距离均比模型组6、
缩短，提示TSG能改善沙鼠缺血/再灌注损伤的学习记忆功能。
脑缺血/再灌注后产生大量的自由基，可攻击细胞膜上多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化，引发细胞功能和代谢上的障碍，直至死亡。超氧化物歧化酶（SOD）可通过清除超氧阴离子保护细胞免受损伤，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，其活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力
［4］
因素可诱导其表达，如在大鼠的大脑皮层、海马、室缺血中心区及其周边均有Nestin的表达管膜下区、并且持续2周
［7－8］
。本实验中，假手术组罕见Nes-
tin蛋白阳性表达，模型组Nestin阳性细胞较假手术组有所增多，主要存在于胞质，呈三角形或多边形，TSG（6、3mg/kg）组Nestin蛋白的表达水平较模型组有明显增高。Nestin的增加代表神经干细胞的增殖，提示TSG可促进脑缺血区域神经干细胞的增殖，对缺血再灌注所导致的脑损伤起到保护作用。哺乳动物中枢神经系统中绝大多数神经干细胞处于静止状态
［9］
。近年来对这种在损伤后受损组织及
［10］
其周边出现Nestin表达的现象持两种观点：一是损伤灶周围的星形胶质细胞重演了胚胎发育过程胞来源于室管膜下区神经干细胞的迁移
［11］
；
另一种观点则认为损伤脑周围的Nestin免疫阳性细
。TSG
是以何种原因促进Nestin表达的，有待进一步研究。
TSG可能通过抗自由基损伤、综上所述，抑制体内脂质过氧化水平及通过上调Nestin表达促进神经对脑缺血/再灌注损伤起到保护作干细胞的增殖，
用，在整体学上表现为学习记忆能力的改善。
参考文献
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林，叶翠飞，等．二苯乙烯苷对脑缺血/再灌注沙
。丙二醛（MDA）为生物膜中的多不饱和脂肪
酸脂质过氧化后的终产物，其含量的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。本实验结果显示：模型组较假手术组沙鼠脑组织中SOD活性明MDA含量明显升高。TSG6、3mg/kg可显显降低，
TSG（6、3、1.5mg/kg）组可明著提高血清SOD活性，
显降低MDA含量。提示TSG具有较强的减轻脂质过氧化反应的作用，能够改善由过氧化引起的脑缺血/再灌注损伤。提示TSG防治沙鼠缺血/再灌注损伤的机制可能是通过提高机体抗氧化能力，保护细胞膜上的多不饱和脂肪酸免受自由基攻击实现
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Effectoftetrahydroxystilbeneglucosideon
gerbilswithcerebralischemia-reperfusioninjury
WangDong，ChenXiaoyu，LiuXiaoli，etal
（DeptofHistologyandEmbryology，AnhuiMedicalUniversity，Hefei230032）
Abstract
Objective
Tostudytheprotectiveandtherapeuticeffectsoftetrahydroxystil-beneglucoside（TSG）on
Theimprovedmethodtoestablishthegerbilscerebralischemia-
cerebralischemia-reperfusioninjury．Methods
reperfusionmodel．Themalegerbilswererandomlydividedintosixgroups：shamgroup，modelgroup，TSGlarge，medium，smalldoses（6，3，1.5mg/kg）groups，thepositivecontrolofedaravonemedicineinjection（3mg/kg）．PxactivityandThefunctionoflearningandmemoryweredetectedbyMorriswatermazeafter7days；SOD，GSH-MDAcontentsweredetectedbybraintissuehomogenate；Nestinproteinexpressionwasdetectedbyimmunohisto-chemicalSABCmethod．Results
Comparedwithshamgroup，thetimeofswimmingoutandthedistanceinmodel
groupwassignificantlyextended．Comparedwithmodelgroup，thetimeofswimmingoutandthedistanceinTSGPxenzymetreatmentgroup，edaravonecontrolgroupobviouslyreduced．Comparedwithshamgroup，SOD，GSH-activityreducedsignificantlyingerbilsbrains，MDAcontentwasobviouslyincreasedinmodelgroup．TSG（6，3Pxenzymeactivity，TSG（6，3，1.5mg/kg）mg/kg）couldsignificantlyimprovetheserumSODactivityandGSH-couldobviouslyreducetheMDAcontent；TheNestinproteinexpressioninTSG（6，3mg/kg）groupwassignifi-cantlyhigherthanthatinmodelgroup．Conclusion
TSGhaspositivelyprotectiveandtherapeuticeffectoncere-bralischemia-reperfusioninjury．Itsmechanismmayberelevantwithfreeradicaldamage，inhibitthebodyoflipidperoxidationandpromotethelevelofnervecellsrepair．Keywords
cerebralischemia-reperfusioninjury；tetrahydroxystilbeneglucoside；freeradical；Nestin