大豆根瘤菌的分离与分子鉴定

第19卷 第5期 黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 19（5）：16～19

文章编号：1002-2090(2007)05-0016-04

大豆根瘤菌的分离与分子鉴定

高亚梅，韩毅强，王景伟，汤辉，孙东梅，王彦杰，王伟东

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院， 大庆 163319）

摘 要：为进一步发掘新的根瘤菌资源，丰富和充实根瘤菌资源库，本研究采用平板分离的方法从大豆根瘤中分

离纯化根瘤菌，获得的菌株进行盆栽回接试验，结果表明分离获得的5株根瘤菌代表菌株均可在大豆上结瘤，具有结瘤能力。根据已公布大豆根瘤菌共同结瘤基因nodA保守区域设计引物对其进行了分子鉴定均获得了nodA PCR 扩增产物，从而在分子水平上实现了对根瘤菌的快速鉴定。

关键词：大豆；根瘤菌；回接鉴定；共同结瘤基因nodA

中图分类号：S154.381 文献标识码：A

Isolation and Molecular Identification of Soybean Rhizobia

GAO Ya-mei, HAN Yi-qiang, WANG Jing-wei, TANG Hui,

SUN Dong-mei, Wang Yan-jie, WANG Jing-wei

Abstract: In order to discover new soybean rhizobia resource and screen highly efficient soybean rhizobia for our region, soybean rhizobia was isolated and purified from soybean nodule by plating and the strains isolated were used to carry out pot culture experiment. Results showed that all the five representative strains gained could nodulate in soybean plant. Therefore all of them had the ability of nodulation. PCR amplification of common nodulation gene nodA was carried out using primer designed acoording to the conserved region of nodA. All the representative strains got nodA PCR products. Therefore the characteristics of strain nodulation belonging to rhizobia could be judged quickly from nodA at the level of molecule.

Key words: soybean; rhizobia; re-inoculation and identification; common Nodulation Gene nodA

0 前言

根瘤菌(rhizobia)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，其侵染豆科植物根部或茎部后形成根瘤或茎瘤，以共生体形式固定空气中的N2为植物可吸收利用的NH4。豆科植物与根瘤菌共生体系具有固氮能力强、固氮量大、抗逆能力强的优点，是生物固氮中效率最高的体系，固氮量约占生物固氮总量的65%。高效固氮菌的开发与应用可以提高土壤肥力，减少长期使用化学肥料带来的经济和环境压力

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。

根瘤菌与豆科植物的共生作用是一个十分复杂的生物学过程，依赖于共生体双方信号分子的识别和交换，并且由根瘤菌和豆科植物多个基因所决定。根瘤菌中与根瘤或茎瘤形成相关的基因称为结瘤基因，它们是根瘤菌侵染豆科植物形成共生器官所必需的。目前发现所有的根瘤菌都具有结瘤基因，结瘤基因分为2类：(1)共同结瘤基因(common nodulationgenes)，其存在于所有的根瘤菌中，如nodABC；(2)宿主专一性结瘤基因(host specific nodulationgenes)，这一类基因只存在于某些根瘤菌种内。共同结瘤基因nodABC是根瘤形成所必需的，其中任何一个基因的突变,都会使菌株

收稿日期：2007-09-06

项目来源：2006农垦总局科技局攻关项目“新型大豆生物肥的研究与应用 ”（HNKXIV-02-03-03）。 作者简介：高亚梅（1977-），女，讲师，华中农业大学硕士研究生毕业，现主从事生物信息学方面的教学与科研工作。 通讯作者：王伟东，男，博士，副教授，硕士研究生导师，E-mail：[email protected]。

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失去结瘤的能力。nodA编码一种结瘤因子的酰基转移酶，该酶催化酰基链向结瘤因子的寡糖骨架转移，直接参与结瘤因子的合成，因此，nodA是根瘤菌关键的结瘤基因之一。

本研究对包括来自黑龙江省不同地区的了几个大豆品种进行了根瘤菌分离和回接实验；根据已公布大豆根瘤菌共同结瘤基因nodA保守区域的设计引物进行了从分子水平鉴定分离根瘤菌是否具有结瘤能力的试验，以期对黑龙江产区的大豆根瘤菌资源的保藏和系统分类地位研究提供科学依据。

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1 材料与方法

1.1 试验材料 1.1.1 菌株

供试菌株包括分离于林甸县大豆品种垦农4号、安达县大豆农家种和黑河19的根瘤的菌株；中科院标准根瘤菌菌种15067；阿根廷利索大豆根瘤菌RL；大肠杆菌。 1.1.2 培养基和试剂

YMA固体培养基：甘露醇10g，酵母粉3g，MgSO4·7H2O 0.20g，NaCl 0.10g，K2HPO4 0.25g，KH2PO4 0.25g，pH 7.0，固体琼脂 15～18g；

TY液体培养基：胰蛋白胨5g，酵母粉3g，CaCl2·6H2O 0.70g，pH 7.0～7.2；

7.0； LB液体培养基：细菌培养用胰化蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，氯化钠10g，pH Fahraeus无氮营养液：CaCl2·2H2O 0.10g，MgSO4·7H2O 0.12g，KH2PO4 0.10g，Na2HPO4·12H2O 0.15g，柠檬酸铁5.0mg；

2.86g，ZnSO4·H2O 0.22g，MnSO4·4H2O 2.03g，NaMoO4·2H2O 0.13g，CuSO4·5H2O 微量元素液：H2BO3 ； 0.08g（使用时接0.1mL加入1L Fahraeus无氮营养液中）

以上培养基、营养液除特殊说明外，配制时均用蒸馏水定容至1000mL，在121℃灭菌30min。 溴百里香酚蓝(BTB)、引物、PCR缓冲液、Taq酶、dNTP均购自宝生物工程有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1根瘤菌的分离与纯化

选取个大、饱满的根瘤，用剪刀将其剪下（带部分根），将根瘤放在清水中浸泡4～5min，洗

去杂质，再用95%乙醇浸泡5min后用0.1%的HgCl2表面灭菌5min，然后用无菌水冲洗10次。在无

菌操作的情况下，将单个根瘤夹破后在YAM培养基上划线，在28℃的温箱中培养3～5d后，挑取少许菌体观察其形态、大小、透明度、粘稠度、颜色、光泽等特征与标准菌对比，将获得的菌体挑入培养基斜面上，继续培养观察，如果菌落无异常，再划线稀释反复分离，直到纯化为止。 1.2.2根瘤菌回接鉴定

将分离获得的菌株与相应的大豆品种进行回接鉴定，中科院标准根瘤菌菌种15067；阿根廷利索大豆根瘤菌RL与垦4进行回接做为结瘤效果的阳性对照，无菌水做为结瘤效果的阴性对照，回接方法采用蛭石双层钵法。将钵体放在温室培养，温度25～30℃，空气相对湿度60%，光照强度5000lx，每周浇无氮营养液100mL，生长40d后测定每株植物的有效根瘤个数，调查与测定重复3次。 1.3.3 根瘤菌及大肠杆菌总DNA提取

菌体的培养和纯培养菌株（根瘤菌和大肠杆菌）总DNA的提取方法参见文献[7]。提取的总DNA经琼脂糖凝胶电泳检测后，利用紫外分光光度计测定浓度后作为PCR扩增模板。 1.3.4 nodA基因PCR扩增

根据NCBI上公布的nodA基因序列（AJ300252）和（AJ302673），BLAST后在保守区设计一对特异性引物，正向引物nodA-1：5′-CRG TGG ARM CTK YGY TGG GAA ART-3′，反向引物nodA-2：5′-TYG GCG RYA 1μL，RRT TKR GAT AGA CAT-3′。PCR反应的总体积为20μL，其中含10×PCR缓冲液2μL，dNTP(10mmoL·L) 0.2μL，引物(10mmol·L)2μL，即nodA-1为1μL，nodA-2为1μL，模板DNA1μL。Taq酶(5U·μL)

反应程序：94℃，4min预变性；94℃，1min→60℃，1min→72℃，1min，30个循环；72℃，5min延伸补平；保存于4℃。

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-1

-1

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2 结果与分析

2.1 分离获得的根瘤菌

对同一土壤种植的不同大豆品种的根瘤，利用平板分离法经镜检和多次纯化分离获得共5株根瘤菌代表菌株，分别定名为安2，垦4-S4-1，垦4-S'84，黑河19 -3，安4。图1为垦4-S4-1菌株在YMA固体培养基上的生长情况。

图1回接实验后的平板划线分离获得的

根瘤菌垦4-S4-1

图2安2回接时的大豆苗及其根瘤

2.2 回接实验的结瘤情况

分离获得的5株根瘤菌分别与其相应的大豆品种进行回接试验，中科院标准根瘤菌菌种15067、阿根廷利索大豆根瘤菌RL与垦4进行回接作为阳性对照，

并设立阴性对照。从菌株的结瘤情况可以看到(图2)，一般情况下每个处理的大豆主根上的根瘤较多，而侧根的根瘤较少。结瘤个数的统计结果表明（表1）不同大豆根瘤菌其平均结瘤个数都在6个以上，分离获得的根瘤菌代表菌株与商品化的阿根廷利索大豆根瘤菌相比，其结瘤个数相当，个别菌株的结瘤个数甚至高于阿根廷利索大豆根瘤菌，具有生产应用的潜力。

表1 分离获得的根瘤菌结瘤情况

处理 安2 安4 黑河19-3 垦4-S’77 垦4-S4-1 垦4RL 15067 CK

重复1 7 15 13 8 11 7 12 0

重复2 5 9 5 10 7 5 4 0

重复3 7 7 8 0 8 8 5 0

平均 6.3 10.3 8.7 6.0 8.7 6.7 7.0 0.0

2.3 nodA PCR扩增

nodA 是根瘤菌关键的结瘤基因之一，所以通过检测nodA的有无可以从基因水平上判断供试菌株是否具有结瘤特性。本研究中设计了一对特异性引物nodA-1、nodA-2进行nodA基因PCR扩增，可以产

生约475bp左右的片段，来自林甸地区的大豆根瘤菌、中科院的标准菌株以及阿根廷利索大豆根瘤菌均产生了nodA基因特异性的条带，而作为对照的大肠杆菌（6号）没有扩增条带（见图3）。由此可见，通过nodA基因扩增产物的有无可以在分子水平上对根瘤菌进行结瘤能力的鉴定，分子鉴定结

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果与回接试验结果相吻合。

1500

1000 900 800 700 600 500 400 300 200

M

2

3

4

6

7

8

图3 采用引物nodA-1、nodA-2所获得的nodA PCR产物

注：从左到右为M：Marker；1：安2；2：垦4S’77；3：垦4S’84；

4：黑河19-3；5：安4；6：大肠杆菌；7：15067；8：垦4-RL。

3 讨论

本研究通过涂平板法从大豆根瘤中分离到5个菌株，应用回接验证试验表明这5个菌株具有结瘤特性，均为大豆根瘤菌，并且结瘤能力与中科院标准菌种15067、商品化的阿根廷利索大豆根瘤菌相当，个别菌株甚至具有更好的结瘤效果。结瘤基因nodA 编码酰基转移酶, 负责将不饱和脂肪酸转移到脂寡聚糖(lipo-chito-oligosaccharides, LCOs)骨架的非还原端, 是根瘤菌关键的结瘤基因之一，普遍存在于不同根瘤菌中，有较大的同源性和互补性。根据大豆根瘤菌nodA基因中的保守序列设计了特异性引物nodA-1、nodA-2，以大豆根瘤菌总DNA作为模板进行PCR扩增。结果表明：所有供试的大豆根瘤菌均可扩增出特异性的PCR产物，而对照的大肠杆菌未得到扩增产物，所以可以通过特异性引物nodA-1、nodA-2扩增nodA基因产物的有无从分子水平鉴定根瘤菌。分子鉴定方法与传统的回接试验相比，具有快速、高效的特点，可以极大地提高根瘤菌分离的效率。

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