北京理工大学生物实验产蛋白酶菌种的分离与纯化

产蛋白酶菌种的分离与纯化--初筛

一、目的要求

1 学习蛋白酶产生菌的筛选方法。

2 掌握稀释涂布平板法从自然环境中分离纯化微生物的基本操作技术。

3 进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。

二、基本原理

土壤是微生物生长的大本营，所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。工业微生物菌种最初都来自于自然界。但是自然界中微生物种类繁多，而且都是混居在一起的，要获得工业发酵菌株，首先必须把它们从混杂的微生物群体中分离出来。 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有：简单单细胞挑取法和平板分离法。本实验用平板分离法。

平板分离法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理包括两个方面：

(1) 选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养，酸碱度，温度和氧等或加入某种抑制剂造成只利于该微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

(2) 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂平板法或平板划线等技术完成。

值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单菌落并不一定保证是纯培养。因此纯培养的确定要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。

蛋白酶是一类重要的工业用酶制剂，它能将蛋白质分解成短肽甚至氨基酸。根据三氯乙酸能将酪蛋白变性从而产生沉淀这一原理，可在平板培养基上直接筛选蛋白酶产生菌株。产酶菌株能将酪蛋白水解成小分子物质，菌落周围不形成沉淀蛋白而出现透明圈，根据透明圈大小还能判断产酶活力。

三、实验器材与试剂

1 样品

土壤样品。

2 培养基

酪素培养基配方如下：

葡萄糖0.5g

NaCl 5g

K 2HPO 4 0.5g

KH 2PO 4 0.5g

干酪素10g

蒸馏水1000ml

琼脂20g

pH 7.5

115℃灭菌30min 。

3 仪器或其他用具

高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱，天平，1mol/L HCl 和1mol/L NaOH ，无菌玻璃涂棒，量筒，移液管，三角瓶，试管，玻璃棒，培养皿，玻璃珠，2.5%三氯乙酸。

四、操作步骤

1 培养基制备

通过称量，溶解，调节pH 等步骤，配制酪素培养基，并配制90 ml 无菌水（内装几颗玻璃珠）1瓶，4.5 ml无菌水若干支，0.1MPa 灭菌30min 后备用；另包扎好培养皿，移液管，玻璃涂棒，枪头等，灭菌，烘干备用。

2 倒平板

将灭过菌的酪素培养基加热融化待冷至55-60℃，以无菌操作法倒至经灭菌并烘干的培养皿中，每皿约 20ml，冷却凝固待用。

3 制备土壤稀释液

称取土样10g ，放入盛90 ml 无菌水并带玻璃珠的三角瓶中，振摇约20 min ，使土样与水充分混合，将细胞分散，即为 10的土壤稀释液。

取4.5 ml无菌水4支，用记号笔编上10，10 ，10，10。用无菌移液管从中吸取0.5ml10的土壤悬液加入盛有4.5 ml无菌水的试管中，充分混匀配成10稀释度的土壤溶液，然后依次吸取0.5 ml 加入别的试管中分别配成10，10，10不同稀释度的土壤溶液。 4 涂布

将上述平板分别用记号笔写上10 ，10，10，每个稀释度标三个平板，然后用无菌移液管分别由10，10，10的土壤稀释液中各吸取100ul 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，室温下静止5-10min ，使菌液吸附进培养基。 5 培养

将涂布好的平板倒置在恒温培养箱中28℃培养2-3天。培养后在平板上滴加2.5%三氯乙酸溶液，以刚铺满平板为度。菌落周围如有无色透明圈出现，说明该菌产生蛋白酶。若杂菌干扰不严重，可适当延长平板的培养时间，以便挑取生长速度较慢的菌株。

五、注意事项

1 平板不要太厚也不要太薄，厚度要适中以利于待分离菌株充分分解酪素。

2 配制培养基时酪素最好先用研钵磨碎之后再加入。

六、实验结果 -3-4-5-3-4-5-3-4-5-1-2-2-3-4-5-1

此次实验，实验结果尚可，在试验组中几乎每一组中都有可以生产蛋白酶的菌落，实验基本上是成功的。但是在实验的过程中依然存在一定的问题，比如说，在周一观察结果是结果并不是很尽人意，往后呢还需要继续改正。在实验操作上基本不存在什么问题，只需要更加的仔细，小心完全的按照实验要求完成即可。

八、思考题

1 除涂布法外，你还知道那些分离方法？比较各种分离方法的优缺点？

答：应该还有平板画线法；稀释倒平板法和搁斜面法。

稀释混合平板法：

优点：可以计数，吸收量为1ml ，较方便。

优点：不能观察菌落特征。

一般用于菌落总数的计数。

平板划线法：

优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离。

缺点：不能计数

一般用于从菌种的分纯。

涂布法使用较多，但有时不均匀

稀释倒平板法操作相对麻烦，不适合好氧和对热敏感的细菌培养

应用范围：涂布法适用于 好氧菌

稀释倒平板法适用于厌氧，兼性厌氧。

2 菌株的选育为什么要分初筛与复筛？

答：在实验过程中菌种的筛选过程实验量是特别大的，而分初筛和复筛可以大大的减少实验量，以提高实验效率。

3 查找资料，根据所在地的特殊生态环境（如盐湖，温泉，酸性土壤等），设计一个筛选

方案来筛选这些生境中的特有微生物。

答：实验过程中大肠杆菌的筛选：