2 HPLC-MS-MS同时检测大鼠血浆中荭草素.牡荆素和槲皮苷(中国实验方剂学杂志)

DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.01.033

第18卷第1期2012年1月

中国实验方剂学杂志

Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae

Vol．18，No．1

2012Jan．，

HPLC-MS-MS 同时检测大鼠血浆中

牡荆素和槲皮苷荭草素、

黄勇，何峰，张治蓉，郑林，兰燕宇，王永林

（贵阳医学院药学院，贵阳

550004）

*

［摘要］目的：建立一种用于同时检测大鼠血浆中荭草素、牡荆素和槲皮苷3种黄酮成分的准确、灵敏的超高液相色谱-串联质谱分析方法，并研究其在大鼠体内的药代动力学。方法：大鼠静脉注射注射用复方荭草后，采用甲醇沉淀血浆蛋白，通0. 1%甲酸水梯度洗脱，过BEH C 18柱分离，乙腈-采用电喷雾离子化三重四极杆串联质谱，以多反应监测（MRM ）方式进行正离433. 2 313. 0（牡荆素）和449. 2 303. 4（槲皮苷）。子检测。用于定量分析的二级碎片离子分别为449. 2 329. 2（荭草素）、

结果：3种黄酮成分在大鼠血浆中线性关系良好，日内、日间精密度（RSD ）均＜15. 71%，准确度在86. 25% 112. 44%之间。3种黄酮成分在大鼠体内的平均滞留时间均较短在21min 以内。结论：本方法快速、专属性强、灵敏度高，适用于注射用复方荭草临床前药代动力学研究。

［关键词］血浆；大鼠；荭草素；牡荆素；槲皮苷；药动学；超高液相色谱-串联质谱［中图分类号］R284. 1

［文献标识码］A

［文章编号］1005-9903（2012）01-0080-05

Simultaneous Determination of Orientin ，Vitexin and

Quercitrin in Rat Plasma by UPLC-MS-MS

HUANG Yong ，HE Feng ，ZHANG Zhi-rong ，ZHENG Lin ，LAN Yan-yu ，WANG Yong-lin *

（School of Pharmacy ，Guiyang Medical Collage ，Guiyang 550004，China ）

［Abstract ］Objective ：To develop a sensitive and reliable ultra performance liquid chromat-ography tandem mass sepctrometry （UPLC-MS-MS ）method for simultaneous determination and pharmacokinetics of orientin ，vitexin and quercitrin in rat plasma．Method ：Following a protein precipitation with methanol for plasma samples after iv Compound Hongcao injection to rat．The analysis was achieved by BEH C 18column and the mobile phase was consisted of acetonitrile and water （0. 1%formic acid included ）follow step gradient elution．A TQD tandem mass spectrometry equipped with electrospray ionization source was used as detector and operated by multiple reaction monitoring （MRM ）positive ion mode of the transitions 449. 2-329. 2，433. 2-313. 0，449. 2-303. 4for orientin ，vitexin and quercitrin ，respectively．Result ：Good linearity was achieved for the three flavonoids ，the intra-and inter-day precisions were lower than 15. 71%，and the accuracy were from 86. 25%to 112. 44%．The MRT of the three flavonoids were all blow 21min in rats．Conclusion ：The method was proved to be suitable for the pharmacokinetics of Compound Hongcao injection ，which offers advantages of rapid ，high sensitivity and selectivity．

［Key words ］plasma ；rats ；orientin ；vitexin ；quercitrin ；pharmacokinetics ；UPLC-MS-MS 荭草素（orentin ）属天然碳苷类黄酮，具有抗氧

［收稿日期］20110604（001）

［基金项目］国家科技重大专项课题（2008ZX09101-021）；国家自然科学基金（30860366）；贵州省科技计划重大专项项目（黔科合重大专

2007］6010号）项字［

［第一作者］黄勇，Tel ：0851-6908899，E-mail ：mailofhy@126．com 硕士生，副教授，从事中药活性物质基础及药动学研究，［通讯作者］

*

化作用，此外荭草素还具有保护心肌细胞、抑制NO

Tel ：0851-6908899，E-mail ：gywyl@gmc．edu．cn 王永林，教授，从事中药活性物质基础研究，

·80·

黄勇，等：HPLC-MS /MS 同时检测大鼠血浆中荭草素、牡荆素和槲皮苷

合酶、抗菌等多种药理活性

［1］

。牡荆素（vitexin ）为2. 3质谱条件Waters Acquity TQD 质谱仪，

异黄酮类化合物，在山楂、地耳草和荭草等多种植物其对缺血性心肌损伤具有良好的保护中都有发现，作用

［2］

MassLynxV4. 1工作站，电喷雾电离源；毛细管电压3kV ；离子源温度120ħ ；去溶剂气温度350ħ ；喷雾

－1

气为N 2（650L ·h ）；碰撞气为Ar 2（0. 16mL ·

。槲皮苷（quercitrin ）为黄酮类化合物，具有

［3］

抗炎、降压和利尿等作用很好的抗病毒、。注射

min －1）；扫描方式为多反应离子监测模式（MRM ），用于定量的正离子对等质谱信息见表1。

表1检测物荭草素牡荆素槲皮苷葛根素（内标）

荭草素等物质的定量离子对和锥孔电压等质谱信息

离子对/（m /z ）499. 2 329. 2433. 2 313. 0449. 2 303. 4417. 0 267. 0

［6-7］

用复方荭草是由黔产荭草为主药研制而成的冻干粉针剂，其内主要含有荭草素、牡荆素和槲皮苷等黄酮临床上拟用于治疗冠心病、心绞痛和心血瘀类成分，

阻证。前期药效学实验结果显示该药可明显改善急性心肌缺血、心肌梗死和降低心肌耗氧量

［4-5］

驻留时间/ms 50505050

锥孔电压碰撞能量

/V 35353530

/eV 30303015

。本

文建立了利用超高液相色谱-串联质谱同时检测大鼠血浆中荭草素、牡荆素和槲皮苷等3种黄酮成分的分析方法，并应用于大鼠静脉注射不同剂量的注射用复方荭草药代动力学研究，为研究该药体内作用规律和临床研究提供了科学依据。11. 1

材料仪器

超高液相色谱色谱-三重四级杆质谱联

2. 4血浆样品处理方法取大鼠血浆100μL ，

－1

30μL 依次加入20μL 葛根素内标溶液（9mg ·L ），

·L －1），400μL 甲醇，甲酸溶液（3mol 涡混1min ，于4ħ 15000r ·min －1离心10min ，取上清液置离心管40ħ 氮吹仪下吹干，中，残留物用200μL 初始流动1μL 进样。相溶解，2. 52. 5. 1

方法学验证专属性

分别取6份空白血浆100μL ，除

Allegra 64R 高速离心机用仪（美国Waters 公司），

（美国Beckman Coulter 公司），MTN-2800D 氮吹仪（天津奥特塞恩斯公司），ZH-2涡旋混合器（天津药典标准仪器厂）。1. 2

试剂与试药

荭草素对照品（批号111777-200801）、9605）购自中国葛根素对照品（批号0752-药品生物制品检定所，牡荆素、槲皮苷对照品为贵阳医学院药物研究开发中心自制（HPLC 检测纯度≥98%），注射用复方荭草（贵州益佰股份有限公司提100mg /支，供，批号20091223），色谱乙腈（德国Merck 公司），其余溶剂均为分析纯。1. 3

动物

健康Wistar 大鼠18只，雌雄兼用，体重

为（210ʃ 10）g ，由贵阳医学院动物中心提供，动物0001。许可证号SCXK （黔）2002-1. 4

数据处理

ʃ s 表示，实验所有数据均用x 珋采

用DAS 2. 0软件（中国数学药理专业委员会）计算各物质药动学参数。22. 1

方法

标准溶液的配制

分别精密称取各对照品适

不加内标外，其余按2. 4项下操作，得典型空白样品色谱图；将3种物质的混合标液和内标溶液加入空白血浆，依法操作，得相应色谱图；取大鼠给药后血依法操作，得相应色谱图，见图1。可以看出大浆，

鼠血浆中内源性物质均不干扰3种物质的测定。2. 5. 2

线性范围和最低检测限（LLOD ）

取大鼠

空白血浆100μL ，分别加入6个逐步稀释的混合标准溶液30μL （n =3），按2. 4项下操作，建立标准曲线。以待测物的峰面积与内标峰面积之比（A /Ai ）为纵坐标Y ，各物质浓度（C ）为横坐标X 进行线性回归，权重系数为1/X ，求得标准曲线。结果3种成分的线性方程分别为Y 荭草素=0. 137X +0. 028（r =

－1

0. 995，线性范围0. 11 27. 66mg ·L ，LLOD 为

15. 23ˑ 10－3mg ·L －1）；Y 牡荆素=0. 162X +0. 007（r =

－10. 998，线性范围0. 05 12. 56mg ·L ，LLOD 为

－1

量，用甲醇溶解并定容，得1. 006g ·L 荭草素，

0. 996g ·L －1牡荆素，1. 01g ·L －1槲皮苷的对照品储·L －1的葛根素内标溶液。备液。同法配制9mg 2. 2

色谱条件

Waters Acquity BEH C 18（2. 1

mm ˑ 50mm ，1. 7μm ）色谱柱，0. 1%甲酸水梯乙腈-度洗脱（0 0. 5min ，10%A ），2. 0 2. 5min ，30% 90%A ，3. 5min 10%A ，流速为0. 35mL ·min －1；柱温45ħ ；进样器温度15ħ 。

0. 55ˑ 10－3mg ·L －1）；Y 槲皮苷=0. 115X +0. 003（r =

－1

0. 991，线性范围0. 02 5. 05mg ·L ，LLOD 为

1. 90ˑ 10－3mg ·L －1）。2. 5. 3

准确度和精密度按

2. 5. 2项下分别配制

低、中、高浓度的质控（QC ）样品，同法配制与定量下限浓度相当的QC 样品，连续测定3d （n =5）。根据当日随行标准曲线计算QC 样品浓度，求得方法

·81·

第18卷第1期2012年1月中国实验方剂学杂志

Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol．18，No．1

2012Jan．，

图1·L －1内标葛根素溶液（图B ）、典型的色谱图分别为空白血浆（图A ）、空白血浆加入3种混合标液和9mg

·kg －1注射用复方荭草40min 后的药动学图谱（图C ）大鼠iv 40mg

的日内、日间精密度和准确度，结果见表2。4个浓度下荭草素等3种成分的日内、日间精密度RSD 分

表2

检测物荭草素

加入浓度/mg ·L 0. 343. 0727. 66

牡荆素

0. 161. 4012. 56

槲皮苷

0. 0620. 565. 05

－1

别小于9. 81%和12. 57%，准确度在81. 81% 113. 32%之间。

准确度

/%94. 70112. 4496. 4586. 25100. 4393. 9290. 6598. 57104. 63

日内精密度RSD /%13. 426. 022. 4015. 716. 924. 619. 627. 733. 93

日间精密度RSD /%

1. 181. 971. 188. 113. 883. 523. 033. 651. 38

ʃ s ，n =5）大鼠血浆中3种物质的日内、日间精密度和准确度（x 珋

x ʃ s 珋0. 32ʃ 0. 043. 45ʃ 0. 2026. 68ʃ 0. 640. 14ʃ 0. 021. 41ʃ 0. 1011. 80ʃ 0. 540. 06ʃ 0. 010. 55ʃ 0. 045. 28ʃ 0. 21

2. 5. 4提取回收率和稳定性按2. 5. 2项下分别此外，实验还考察了低、中、高3个浓度的含药血浆样品在室温（约20ħ ）下放置6h ，－20ħ 下冷藏3d ，经测定3种情况下得到的2种物质的峰面积与零时间点的偏差均在15%以内，提示实验条件下血浆样品稳定性良好。2. 6

方法学应用

［8-9］

配制低、中、高浓度的QC 样品；另取空白血浆，按2. 4项下操作，离心后获得上清液，加入与上述样品等浓度的混合标液（n =5），于40ħ 氮吹仪下吹干，残留物用200μL 流动相溶解，获得相应峰面积，以每一浓度的2种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。经测定3种成分的提取回收率分别为荭草素82. 75% 93. 92%、牡荆素80. 83% 100. 00%、槲皮苷74. 41% 103. 04%。同法测定内标的提取回收率为101. 37%。·82·

将18只Wistar 大鼠随机分

40，80mg ·kg －1）3个剂量组，为低、中、高（20，给药自由饮水。大鼠尾静脉注射复方荭草前禁食12h ，

20，30，40，50，60，药液，分别于给药前与给药后10，75，90min 经尾静脉取血约0. 3mL ，4000r ·min －1

黄勇，等：HPLC-MS /MS 同时检测大鼠血浆中荭草素、牡荆素和槲皮苷

离心10min ，血浆置于－20ħ 冰箱中保存至分析。样品测定方法按2. 4项进行，每批次生物样品测定中、高3个浓度的QC 样品，根随行标准曲线及低、

据每一分析批的标准曲线计算QC 样品和未知样品的浓度。3

结果

大鼠静脉注射低、中、高3个剂量的注射用复方3种物质的平均c-t 曲线见图2，荭草后，采用DAS2. 0软件对药动学参数进行拟合（主要药动学参数见表3）。所有批次实验的低、中、高QC 样品回符合生物样品分收率均在85. 0% 115. 0%之间，析方法的要求

。

图2t 曲线（n =6）大鼠静脉注射3个剂量注射用复方荭草后3种黄酮的c-表3

低、中、高剂量下3种黄酮的主要药动学参数（n =6）

AUC /（mg ·min ·L －1）

高20. 4817. 4417. 66

低79. 8745. 0311. 04

中

高

低6. 98

V z /（L ·kg －1）

中8. 6421. 8861. 38

高11. 0420. 4575. 55

CL /（L ·min －1·kg －1）低0. 38. 154. 89

中0. 2410. 991. 77

高0. 2514. 491. 72

检测物荭草素牡荆素槲皮苷

T 1/2β/min 低10. 447. 7014. 16

中14. 7210. 519. 44

高13. 7920. 2314. 72

低12. 418. 5210. 47

MRT /min

中17. 8015. 4515. 60

204. 39307. 48

114. 25159. 3312. 5931. 01

42. 6971. 38

4讨论

UPLC-MS-MS 与HPLC-UV 相比，检测灵敏度大

滞留时间短；3种黄酮成分的血药浓度在大鼠体内都呈现特征性的三室动力学特征；对低、中、高3个剂量组下3种物质的AUC 进行剂量校正后单因素方差分析，在实验剂量下荭草素表现出了线性药动学的特征，而牡荆素和槲皮苷则表现出了非线性药动学的特征，高剂量下代谢酶的饱和可能是产生非线性药动学的原因。由c-t 曲线可以发现，高剂量组下3种物质在60min 处出现了一个较小的吸收峰，与文献中报道黄酮类的药物多存在双峰现象较为一致，肝肠循环可能是导致此现象的重要原因。

利用质谱全扫描模式发现给药后血浆中有代谢物的色谱峰迅速出现，提示注射用复方荭草在大鼠体内可能存在比较快速的生物转化。荭草素和牡荆素的碳苷键难以水解，推测其在体内可能以甲基化和羟基的葡萄糖醛酸化等二相代谢为主，对于代谢产物的分析还有待进一步的研究。

·83·

大提高，专属性强，短时间即可完成对一个样品的分析。本实验需用血浆量较少，利于大鼠连续取血。

－1

经预实验确证在血浆中加入30μL 3mol ·L 甲酸

后可使各检测物质更充分地由蛋白解离，增加提取回收率。用甲醇沉淀血浆蛋白，不仅可以有效提取荭草素、牡荆素和槲皮苷，同时也能很好地溶解内标流动相中0. 1%甲酸溶液的加入，有葛根素。此外，

助于改善各物质的峰形和提高灵敏度，同时实验中我们还对血浆样品的基质效应进行了考察，结果显示各浓度血浆样品均无明显的基质效应干扰。本文为注射用复方荭草的临床前研究提供了稳定可靠而又方便易行的分析方法。

药代动力学参数显示，荭草素、牡荆素和槲皮苷在大鼠体内的分布和消除半衰期很短，在体内平均

第18卷第1期2012年1月中国实验方剂学杂志

Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol．18，No．1

2012Jan．，

HPLC 测定裸花紫珠药材中毛蕊花糖苷的含量

1121*

李才堂，文萍，郭琦丽，虞金宝

（1. 江西省中医药研究院，南昌330046；2．江西护理职业技术学院，南昌330029）

［摘要］目的：测定裸花紫珠药材中毛蕊花糖苷的含量。方法：采用HPLC ，色谱条件为Dikma Diamonsil C 18（钻石）（4. 6mm ˑ 250mm ，5μm ），0. 1%醋酸（16ʒ 84）为流动相，·min －1，乙腈-流速1mL 检测波长332nm ，柱温室温。结果：毛蕊花糖苷在8. 24 206mg ·L －1线性关系良好（r =0. 9995），RSD 为2. 31%（n =6），加样回收率为98. 74%，重复性RSD 为2. 12%（n =6）。结论：该方法简便可行，重复性好，可用于裸花紫珠药材的质量控制。

［关键词］裸花紫珠；毛蕊花糖苷；高效液相色谱法［中图分类号］R284. 1

［文献标识码］A

［文章编号］1005-9903（2012）01-0084-03

HPLC Determination of Verbascoside in Callicarpa nudiflora

LI Cai-tang 1，WEN Ping 1，GUO Qi-li 2，YU Jin-bao 1*

（1．Jiangxi Institution of Trational Chinese Medical and Pharmaceutical Science ，Nanchang 330046，China ；

2．Jiangxi Care Vocational and Technical College ，Nanchang 330046，China ）

Abstract ］Objective ：To determine the content of verbascoside in Callicarpa nudiflora ．Method ：HPLC ［

was performed with chromatographic conditions as follows ：Dikma Diamonsil C 18column （4. 6mm ˑ 250mm ，5the mobile phase of acetonitrile-0. 1%acetic acid （16ʒ 84），flow rate at 1mL ·min －1，and the detection μm ），

wavelength at 332nm．Result ：The linearity of verbascoside was good in the range 0f 8. 24-206mg ·L －1（r =0. 9995）．The average recovery was 98. 74%，RSD was 2. 31%，with good repeatability RSD was 2. 12%，（n =6）Conclusion ：The method is simple ，feasible and reproducible ，and can be used to control the qualitv of C．

［收稿日期］20110511（010）

［第一作者］李才堂，Tel ：0791-88501125，E-mail ：lict963@sina．com 硕士，助理研究员，从事中药新药研发及质量标准，［通讯作者］

*

Tel ：0791-88501404，E-mail ：yjb2217@163. com 虞金宝，研究员，从事中药制剂及质量控制，

檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶［参考文献］

［1］张淑贤，管庆霞．荭草的化学成分及药理学研究进展

［J ］．黑龙江医药，2008，21（5）：97．

［2］朱晓新，李连达，刘建勋，等．牡荆素鼠李糖苷对缺氧

再给氧损伤心肌细胞的保护作用研究［J ］．中国天然2003，1（1）：44．药物，

［3］李钦，郑晓亮，陈爱君，等．槲皮苷防治溃疡性结肠炎

2009，26的药效学研究［J ］．中国现代应用药学杂志，（3）：180．

［4］陶玲，沈祥春，王永林，等．复方荭草冻干粉针剂对麻

2006，醉犬血流动力学的影响［J ］．贵阳医学院学报，31（2）：142．

［5］荣华，李大锋．复方荭草冻干粉针剂治疗冠心病心绞

2008，痛（心血瘀阻证）临床研究［J ］．湖北中医杂志，30（3）：14．

［6］俞建平，张文婷，祝明．高效液相色谱法测定鱼腥草中

2008，27（3）：331．槲皮苷的含量［J ］．医药导报，

［7］潘莹．大鼠口服川芎和通脉方后阿魏酸的药动学比较

［J ］．中国实验方剂学杂志，2011，17（4）：193．［8］童成亮，刘晓东．HPLC 法测定犬血浆中牡荆素及药

2006，22代动力学研究［J ］．中国药理学通报，（9）：1149．

［9］胡楠，梁日欣，王岚，等．延胡索提取物在大鼠血浆中

2011，的药代动力学研究［J ］．中国实验方剂学杂志，17（4）：186．

［责任编辑蔡仲德］

·84·