蛋白消化流程
有还原烷基化蛋白质消化操作流程
1. 将所选择的胶点用1.5mm 切胶笔切下，置于eppendorf (EP) 管或96孔PCR 板
中, 并记录点号及相应的位置；
2. 加50μL DD.H2O 洗两次，10min/次；
3. 加50 mM NH4HCO 3/乙腈=1：1溶液(考染脱色液)50μL ，超声脱色5min 或37℃
脱色20min ，吸干；(若为银染, 一般不需要脱色; 若必须脱色, 使用15mM 3CN 62234. 重复步骤3，直至蓝色褪去；
5. 加乙腈50μL 脱水至胶粒完全变白，真空抽干10min ；
6. 加10 mM DTT（10μL 1M DTT，990μL 25mM NH4HCO 3配制） 20μL ，56℃
水浴1hr ；
7. 冷却到室温后，吸干，快速加55 mM IAM （55μL 1M IAM，945μL 25mM
NH 4HCO 3配制）20μL ，置于暗室45min ；
8. 依次用25 mM NH4HCO 3 ( 2X10分钟) 、25 mM NH4HCO 3 +50％乙腈溶液( 2X10
分钟) 和乙腈洗(10分钟) ，乙腈脱水到胶粒完全变白为止，真空抽干10min ；
9. 将0.1μg/μL 的酶储液以25 mM NH4HCO 3稀释10~20倍，每EP 管加2~3μL ，
稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4℃或冰上放置30min ，待溶液被胶块完全吸收，加25mM NH4HCO 3 至总体积10-15μL 置37℃，消化过夜；
10. 加入甲酸终止反应，使甲酸终浓度为0.2％，振荡混匀，离心。
说明:
1. 每加一次溶液都要漩涡振荡，胶粒要完全浸没在溶液中，进行下一步操作前要把溶液吸走。
2．如果胶粒超过1.5mm 3, 把胶粒分成约为1.5mm 3大小再进行脱色，使用的各种溶液的量也相应增加。
3．实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净，防止角蛋白污染，并带
口罩和帽子。
4．银染蛋白质点胶内消化不要脱色，步骤3、4省略。
5. 所有在洁净台外的操作必须用封口膜密封好96孔板, 尽量避免蛋白质点和相关溶液与外界空气接触, 避免可能造成的污染.
全蛋白溶液消化操作规程
一、 试剂：
1．变性缓冲液：6M Guanidine-HCl，50mM Tris-HCl,(pH8.0)或6-8M 尿素，50mM
Tris-HCl,(pH8.0)
2．1M DTT
3．1M IAM
4．50mM NH4HCO 3(pH7.8)
5．Trypsin 酶
二、 操作步骤：
1．将蛋白溶解于6M Guanidine-HCl或6-8M 尿素或0.1% SDS, 50mM
Tris-HCl,(pH8.0);
2．往溶液中加入1M DTT至终浓度2-5mM;
3．95℃加热15-20min 或者60℃加热45-60min，冷却至室温；
4．加入1M IAM至终浓度10-25mM，室温暗处孵育45min；
5．加入50mM NH4HCO 3(pH7.8)稀释Guanidine-HCl 或尿素至终浓度不超过1M ；
6．按Trypsin 酶与底物蛋白的量之比在1：20-1：100之间，加入酶液，37℃孵
育8-12Hr;
7．再次加入同等剂量的Trypsin 酶溶液，室温孵育24Hr ；
8． 浓缩样品到合适的体积。
三、 注意事项：
样品中避免存在以下常见的胰蛋白酶抑制剂
Antipain (50µg/ml), antithrombin (1unit/ml), APMSF (0.01–0.04mg/ml),
aprotinin(0.06–2µg/ml), leupeptin (0.5µg/ml), PMSF (17–170µg/ml), TLCK (37–50µg/ml) trypsin inhibitors (10–100µg/ml).