RNA探针原位杂交
3.2.1 胚胎整体原位杂交
按实验要求收集不同发育时期的胚胎(Kimmel et al., 1995) ，用4%多聚甲醛 (分析纯，国产) （4%多聚甲醛溶解在1×PBS(13mM氯化钠、0.7mM 磷酸氢二钠、0.3mM 的磷酸二氢钠（均为分析纯，国产）) 中，4℃固定胚胎过夜(最长不超过26小时) 。第二天在4%多聚甲醛中去除壳膜。
胚胎去除壳膜后在室温下脱水，先用25%甲醇(国产, 分析纯) 和75%固定液的混合液孵育胚胎5分钟，再换为50%甲醇和50%固定液孵育5分钟，然后无水甲醇孵育两次，每次5分钟。脱水之后于无水甲醇透明。经甲醇在-20℃脱水透明1小时后的胚胎, 即可用于原位杂交。原位杂交时，先将胚胎在25% 1×PBST （含有0.1%Tween-20（Amercso ，美国）的1×PBS ）和75%甲醇的混合液中室温孵育5分钟，然后放入50% 1×PBST 和50%甲醇的混合液中孵育5分钟；最后，以100%PBST孵育两次，每次5分钟。之后将胚胎转移到hyb-液（50%甲酰氨（Ambion ，美国），5×SSC 和0.1% Tween-20）里在杂交炉（UVP HL-2000 Hybrilinker, 美国）中65℃孵育5分钟。 然后换入预杂交液hyb+（hyb-，含有终浓度为500ug/ml酵母RNA （Sigma, 美国）和50ug/ml肝素（Sigma, 美国））65℃ 预杂交4小时。
加入探针之前，将地高辛标记的RNA 探针加入到新鲜的hyb+ 中，65℃ 10分钟以使探针RNA 变性，冰上放置 5分钟后，加入到胚胎中，65℃杂交过夜。杂交时，探针浓度为0.5-1ng/µl 。
杂交后，洗去非特异性结合的探针。首先用2×SSCT 、50% 甲酰氨、0.1% Tween-20 混合液65℃洗30分钟，洗两次；然后用2×SSCT 65℃洗15分钟；最后用0.2×SSCT65℃洗两次，每次30分钟。
非特异性结合的探针去除后，将胚胎在室温下封闭1小时。封闭时，先将胚胎用MABT （100 mM 马来酸（Maleic acid，MAB Sigma，美国），150 mM 氯化钠（分析纯，国产），0.1%Tween-20，pH7.5） 洗三次，每次5分钟。然后换入封闭液（2%的封闭剂（Blocking regent， Roche, 美国），10%的绵羊血清 (国产) ，70%的MABT ）, 孵育一小时。最后加入含有1/5000 稀释的地高辛抗体（Anti-Digoxigenin-AP Fab fragment，来自绵羊），Roche ，美国）的封闭液，4℃
过夜。
抗体反应完全后，需洗去非特异性结合的抗体。即用MABT 每隔45-60分钟洗一次，共8次，最后一次在4℃过夜。
洗去非特异性结合的抗体后，可进行显色。显色时，先加入平衡液（0.1M 氯化钠，0.1M Tris-HCl （pH=9.5）, 0.05M 氯化镁（分析纯，国产），0.1% Tween-20 ）（含0.5 mg/ml of Levamisol (Sigma，美国) ），将胚胎在室温下孵育10分钟。同时，将胚胎转移到12孔板中 (Costar，美国) 。10分钟后，吸出平衡液，换入显色液（每1ml 含有 1.2mg/ml Levamisol的平衡液中加入4.5µl 75mg/ml NBT（Nitro blue tetrazolium chloride ，Roche ，美国）和3.5µl 50mg/ml BCIP （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate， Roche ，美国）。用铝伯纸包裹12孔板，室温显色6-8小时。然后，吸出显色液，用PBST 洗1次，5分钟后，无水甲醇脱水2次，每次10分钟。吸出甲醇，加入包埋剂（按2：1混合的Bezylbenzoate 和 Benzylalcohol （Sigma ，美国) ）。静置几分钟后，观察结果并用拍照纪录。