蛋白质的测定
蛋白质的测定
食品中的蛋白质含量
在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同,一般说来动物性食品的蛋白质高于植物性食品,例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右,猪肉中为9.5%,兔肉为21%,鸡肉为20%,牛乳为3.5%黄鱼为17.0%,带鱼为18.0%,大豆为40%,稻米
8.5%,面粉为9.9%,菠菜为2.4%,黄瓜为1.0%,桃为0.8%,柑橘为0.9%,苹果为0.4%和油菜为1.5%左右。
测定食品中蛋白质的含量,对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。
蛋白质测定方法
测定蛋白质的方法可分为两大类:
一类是利用蛋白质的共性,即含氮量 、肽键和折射率测定蛋白质含量 ;
另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。
蛋白质的测定,目前多采用将蛋白质消化,测定其含氮量,再换算为蛋白质含量的凯氏定氮法。不同食品的蛋白质系数有所不同。
凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一,可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析,可同时测定多个样品,故国内外应用较为普遍,是个经典分析方法,至今仍 被作为标准检验方法。
凯氏定氮法:常量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法。 微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少,且有一套微量凯氏定氮器。
目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法。 在凯氏法改良中主要的问题是,氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题,即分解试样所用的催化剂。
常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。
常量凯氏定氮法
(1) 原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出,而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏,使氨蒸出,用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。
(2) 适用范围
此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定
(3)仪器
①500ml凯氏烧瓶;②定氮蒸馏装置
(4)试剂
①硫酸铜 ; ② 硫酸钾;③ 硫酸; ④ 40g∕L硼酸溶液; ⑤ 混合指示剂; ⑥ 400g∕L氢氧化钠;⑦0.1mol∕L盐酸 标准溶液
(5) 操作步骤
① 样品消化:准确称取均匀的固体样品0.5~3g,或半固体样品2~5g,或吸取溶液样品15~25ml。小心移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.5~1g硫酸铜、10g硫酸钾及25ml浓硫酸,小心摇匀后,于瓶口置一小漏斗,瓶颈45°角倾斜置电炉上,在通风橱内加热消化(若无通风橱可于瓶口倒插入一口径适宜的干燥管,用胶管与水力真空管相连接,利用水力抽除消化过程所产生的烟气)。先以小火缓慢加热,待内容物完全炭化、泡沫消失后,加大火力消化至溶液呈蓝绿色。取下漏斗,继续加热0.5h,冷却至室温。
② 蒸馏、吸收
按图装好蒸馏装置,冷凝管下端浸入接受瓶液面之下(瓶内预先装有50ml 40g∕L硼酸溶液及混合指示剂5~6滴)。凯氏烧瓶内,加入100ml蒸馏水、玻璃珠数粒,从安全漏斗中慢慢加入70ml 400g/L氢氧化钠,溶液应呈蓝褐色。不要摇动,将定氮球连接好。用直火加热蒸馏30min,将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏1min,用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。
③ 滴定:将接受瓶内的硼酸液用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白(除不加样品,从消化开始操作完全相同)。
式中W—蛋白质的质量分数,%;
c—盐酸标准液的浓度,mol/L;
V1—空白滴定消耗标准液量,mL;
V2—试剂滴定消耗标准液量,mL;
m—样品质量,g;
0.014—氮的毫摩尔质量,g/mmol;
F—蛋白质系数。
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同,故各种不同的蛋白质其含氮量也不同,一般蛋白质含氮量为16%,即一 份氮素相当于6.25份蛋白质,此数值(6.25)称为蛋白质系数。
微量凯氏定氮法
(1) 原理
微量凯氏定氮法的原理与操作方法,与常量法基本相同,所不同的是样品质量及试剂用量较少,且有一套适于微量测定的定型仪器——微量凯氏定氮器。
1.100ml凯氏烧瓶。
2.微量凯氏定氮器。
(3) 试剂
①20g/L硼酸溶液。
②400g/L氢氧化钠。
③1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L溴甲酚绿乙醇溶液,临用时按1:5混合。 ④0.01000mol/L盐酸标准溶液
⑤其他试剂同常量法。
①样品消化:样品消化步骤同常量法。将消化完全的消化液冷却后,完全转入100容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀。
② 蒸馏
按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处,加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升,以保持水呈酸性,加入数粒玻璃珠,加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。在接受瓶内加入10ml 40g/L硼酸及2滴混合指示剂,将冷凝管下端插入液面以下。
吸取10.00ml样品消化稀释液,由进样漏斗进入反应室,以少量水冲洗进样漏斗,并流入反应室。再从进样口加入400g/L氢氧化钠10ml使溶液呈强碱性,用少量蒸馏 水洗漏斗数次,盖塞 ,进行水蒸气 蒸馏。冷凝管下端 预先插入盛有10mL4%(或2%)硼酸吸收液,蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始记时,继续蒸馏10min后,将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min,用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。
③ 滴定
取下接受瓶,以0.01000mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。
(5) 结果计算
式中W—蛋白质的质量分数,%;
V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积,mL;
V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积,mL;
V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积,mL;
C—盐酸标准液的浓度,mol/L;
0.014—氮的毫摩尔质量,g/mmol;
F—蛋白质系数;
m—样品质量,g。
注意事项
(1)所用试剂应用无氨蒸馏水配制。
(2)消化过程应注意转动凯氏烧瓶,利用冷凝酸液将附在瓶壁上的炭粒冲下,以促进消化完全。
(3)若样品含脂肪或糖较多时,应注意发生的大量泡沫少量辛醇或液体石蜡,或硅消泡剂,防止其溢出瓶外,并注意适当控制热源强度。
(4)若样品消化液不易澄清透明,可将凯氏烧瓶冷却,加入300g/L2~3ml过氧化氢后再加热。
(5)若取样量较大,如干试样超过5g,可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。
(6)消化时间一般约4小时左右即可,消化时间过长会引起氨的损失。一般消化至透明后,继续消化30min即可,但当含有特别难以氨化的氮化合物的样品,如含赖氨酸或组氨酸时,消化时间需适当延长,因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全,往往导致总氮量偏低。有机物如分解完全,分解液呈蓝色或浅绿色。但含铁量多时,呈较深绿色。
(7)蒸馏过程应注意接头处无松漏现象,蒸馏完毕,先将蒸馏出口离开液面,继续蒸馏1min,将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内,再将吸收瓶移开,最后关闭电源,绝不能先关闭电源,否则吸收液将发生倒吸。
(8)硼酸吸收液的温度不应超过40°C,否则氨吸收减弱,造成损失,可置于冷水浴中。
(9)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色。
双缩脲法(Biuret法)测蛋白质含量
试剂与器材
1. 试剂:
(1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1mg/ml的A280为 0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05N NaOH配制。
(2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4•5H2O)和 6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6•4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。
2. 器材:
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
操作方法
1. 标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,
0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(20~25℃)下放置30分钟,于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定:取2~3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。