胃蛋白酶水解酪蛋白生成_酪啡肽_7的研究
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2010No.4Serial No.217
China Brewing
Research Report
胃蛋白酶水解酪蛋白生成β-酪啡肽-7的研究
王立晖1,袁永俊2,孙勇民1,李培俊3
(1. 现代职业技术学院,天津300222;2. 西华大学,四川成都610039;3. 温州质量技术监督检测院,浙江温州325027)
摘要:研究酪啡肽生成最佳水解条件的确立。首先通过单因素试验研究了底物浓度、酶浓度、温度和pH 值对水解的影响,并依据水
解度的差异,选取了单因素最佳条件,而后选取4因素3水平正交试验设计对最佳酶解条件进一步探讨,确定最佳酶解条件为酪蛋白底物浓度10mg/mL,酶浓度1%,pH1.6,55℃水浴。关键词:水解度(DH );胃蛋白酶;β-酪啡肽-7中图分类号:Q556
文献标识码:A
文章编号:0254-5071(2010)04-0064-03
Production of β-Casomorphin-7by pepsin from casein
WANG Lihui 1, YUAN Yongjun 2, SUN Yongmin 1, LI Peijun 3
(1.Tianjin Modern Vocation Technology College, Tianjin 300222, China; 2. Xihua University, Chengdu 610039, China;
3. Wenzhou Institute of Technology and Calibration, Wenzhou 325027, China)
Abstract:The optimal production conditions of β-Casomorphin-7from casein by pepsin were investigated in this paper. The optimal conditions were obtained through single factor experiment and orthogonal experiment as followed:the substrate concentration of casein 10mg/ml,the concentration of enzyme 1%,pH 1.6and the temperature of water bath 55℃. Key words:degree of hydrolysis; pepsin; β-Casomorphin-7
β-酪啡肽-7是含有7个氨基酸残基的寡肽[Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile],为β-酪蛋白第60~66氨基酸残基片段,与μ型受体具有良好的亲和力,并呈现出阿片肽类所具有的特征[1-2]。本研究选取酪蛋白为最基础试验原料,选取胃蛋白酶为水解酶,通过部分试验,探讨胃蛋白酶酶解酪蛋白制备酪啡肽的最佳生成条件。最佳生成条件以水解度为参考,以色谱检测结果为最终判断依据。根据平均肽链长度的估计设定l PCL 为酶水解后得到的多肽的平由于目标产物为7肽,所以推均链长则l PCL ≈1/DH×100%,
收稿日期:2010-12-03
基金项目:四川省科技厅应用基础项目(0325127)
测最佳水解度为14%左右。酶解样品进样的色谱峰的有无与峰行峰面积的比较作为胃蛋白酶酶解酪蛋白制备酪啡肽的最佳生成条件探讨的最终依据。试验通过单因素试验研究了底物浓度、酶浓度、温度和pH 值对水解的影响,并依据水解度的差异,选取了单因素最佳条件。而后取4因素3水平正交试验设计对最佳酶解进行探讨,并根据试验结果结合实际因素得出最佳试验条件。并进而研究水解时间与水解度的关系,并且参考14%水解度,以0.5h 时间间隔为),以备后面的分离和检测试验。限制备样品一组(7个
),河北石家庄人,讲师,研究方向食品生物技术。作者简介:王立晖(1981-
由表2可以看出,橄榄总黄酮对大肠杆菌和变形杆菌有较强的抑制作用,最低抑菌浓度均为0.25mg/mL;橄榄总黄酮对枯草杆菌、青霉和黑曲霉的抑制更强作用,最低抑
橄榄总黄酮对痢疾杆菌和金黄色葡菌浓度为0.125mg/mL;
萄球菌的抑制作用最强,最低抑菌浓度均为0.0625mg/mL。
由表1和表2试验结果得出,橄榄总黄酮抑菌作用大小依次为:痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌>枯草杆菌、青霉、黑曲霉>大肠杆菌,变形杆菌。3结论
金黄色葡萄球菌、变形杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、枯草杆菌、青霉和黑曲霉等(细菌/霉菌)是食品加工、储存过程中常见的腐败菌种,在自然界中分布也较广泛,容易引起食物腐败和食物中毒。本实验结果表明,橄榄黄酮对以上菌种均有较强的抑制作用,特别是对痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌抑制作用非常显著。加之我国橄榄年产量巨大,
在天然产物研究与开发利用已成为世界潮流的今天,橄榄总黄酮用来作天然食品防腐剂前景广阔。参考文献:
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研究报告
1试验材料与仪器1.1试验材料
中国酿造
2010年第4期总第217期·65·
pH1.4,温度50℃的条件下,调节底物浓度在酶浓度1%,
10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL,分别为5mg/mL、
干酪素(生化试剂):北京奥博生物技术责任有限公司;胃蛋白酶(P-7000):北京拜尔迪生物公司(Sigma 进口分装);甲醛(分析纯):成都科龙化工试剂厂;其他所用药品均为分析纯。1.2试验仪器
PHS-25型pH 计:上海雷磁仪器厂;78HW-1型恒温磁力搅拌器:江苏省金坛市医疗仪器厂;SHA-B 型水浴恒温振荡器:江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;HH 恒温水浴锅:郑州杜甫仪器厂;DHG-9075A 型电热恒温鼓风干燥箱:上海一恒科技有限公司;BS-200S 电子天枰:北京赛多利斯天平有限公司。2水解试验
2.1单因素和正交水解试验
准确称取定量酪蛋白,碱性条件下用85℃、0.1mol/L氢氧化钠溶液100mL 溶解,再用盐酸或氢氧化钠溶液调节至需要的pH 值,并用容量瓶定容。用容量瓶准确倒取100mL 酪蛋白溶液入锥形瓶中,然后加入称好的固体酶,搅拌均匀后置恒温振荡水浴锅中水解,计时并维持酶的最适合作用条件,到时后取出,立即用浓碱液滴定至中性灭酶。确定影响酶解的温度、pH 值、底物浓度、酶浓度4个因素中的3个做单因素试验。再根据单因素试验结果,设计L (93)
4
正交试验,以分析此试验条件下酪蛋白充分水解的条件。2.2水解度的测定
[3-4]
具体操作方法:取灭酶后酶液10mL ,去二氧化碳蒸馏水30mL 于小烧杯中,调节pH 值至8.2,再加入10mL 中性甲醛,反应1min 后,用标准氢氧化钠滴定至pH9.2,记下初点值和终点值。空白试验:取未加酶水解的酪蛋白溶液10mL ,其余操作同上。
水解度计算公式:
M (V-V 0)×1000
DH=wo 1×100%式中:DH 为酪蛋白的水解度;M 为NaOH 溶液的浓度,mol/L;
V 为水解液滴定时消耗的氢氧化钠溶液的体积,mL ;V 0为空白液滴定时消耗的氢氧化钠溶液的体积,mL ;C wo 为所取酪蛋白溶液的浓度,mg/mL;V 1为所取酪蛋白溶液的体积,mL ;X 为酪蛋白样品中蛋白质的含量,测得X=0.785;8.2为每克酪蛋白中所含的肽键数,mmol/g。
2.3样品制备
根据上述试验结合实际需要确立的最佳酶解条件,在相同试验条件下以时间为调节因素分别水解0.5h 、1h 、1.5h 、2h 、2.5h 、3h 、3.5h 制备酪蛋白水解样品一组(7个)。3结果与分析3.1单因素试验
3.1.1底物浓度与酪蛋白水解的关系
水浴水解2h 。试验结果见表1。
表1
底物浓度对水解度和水解速度的影响
Table 1. Effect of substrate concentration on DH and hydrolysis rate
项目底物浓度(/mg ·mL -1)
510152025DH/%15.5110.869.197.535.16水解速度(/g ·h -1)
0.0388
0.0543
0.0689
0.0753
0.0645
根据酶解动力学分析,再结合试验所需水解度约为14%,底物浓度为5mg/mL时水解度比较理想,为15.51%,但是考虑到底物浓度过低可能会导致产物产量过小,底物浓度达到15mg/mL时水解度偏低不能满足试验要求。故最终选择底物浓度为10mg/mL。3.1.2酶浓度与酪蛋白水解的关系
在底物(酪蛋白)浓度10mg/mL,pH1.4,温度50℃的条件下,调节酶浓度分别为0.5%、1%、1.5%、2%,水浴保温水解2h 。试验结果见表2。
表2
酶浓度对水解度和水解速度的影响
Table 2. Effect of enzyme concentration on DH and hydrolysis rate
项目酶浓度/%
0.511.52DH/%8.3610.8611.8212.05水解速度(/g ·h -1)
0.0418
0.0543
0.0591
0.0603
根据酶解动力学分析当[E]>1%时,水解速度提高不明显,结合需要的理想水解度为14%和经济原因,最终采取酶浓度为1%。
3.1.3pH 值与酪蛋白水解的关系
在酪蛋白10mg/mL,酶浓度1%,温度50℃的条件下,调节pH 值分别为1.2、1.4、1.6、1.8、2.0,水浴保温水解2h 。试验结果见表3。
表3
pH 值对水解度和水解速度的影响
Table3. Effect of pH on DH and hydrolysis rate 项目pH 值
1.21.41.61.82.0DH/%8.3610.869.828.866.05水解速度(/g ·h -1)
0.0418
0.0543
0.0491
0.0443
0.0303
由表3可以看出,在其他条件一定的情况下,水解度和水解速度随pH 值的变化呈现抛物线型的变化,故pH 值为1.4为此试验条件下的最适合pH 值。3.1.4温度与酪蛋白水解的关系
在酪蛋白10mg/mL,酶浓度1%,pH1.4的条件下,调节
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水解温度分别为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃,水浴保温水解2h 。试验结果见表4。
表4
温度对水解度和水解速度的影响
结果见表5。温进行4因素3水平正交试验,
由表5可以看出,各因素最佳水平A 1B 3C 3D 3,估计最佳组合试验值y =8.53+2.36+1.46+0.5+0.24=13.10,各因素主次顺序为A (底物浓度)>B(酶浓度)>C(pH 值)>D(温度)。
根据单因素和正交表的结果,再结合需要选取的最佳水解度值和经济因素,最后确定最佳水解方案为酪蛋白底物浓度10mg/mL,酶浓度1%,pH1.6,水浴温度55℃。4样品制备
以最佳因素为固定条件以水解时间为变化条件做试验样品一组,研究水解时间与水解度的关系,试验结果见表6。
表6
水解度与水解时间的关系
时间/h
0.57.761
1.09.382
1.510.613
2.011.424
2.512.245
3.013.016
3.514.157
Table 4. Effect of temperature on DH and hydrolysis rate 项目DH/%水解速度(/g ·h -1)
温度/℃
358.940.0447
409.650.0483
4510.360.0518
5010.860.0543
5510.460.0523
由表4可以看出,在其他条件一定的情况下,水解度随温度的变化呈现抛物线型的变化,从30℃~50℃水解度和水解速度均呈上升趋势,50℃达到最大水解度和水解速度,随后这些数值又随着反应温度的升高而降低,故此水解条件下选取最适温度50℃。3.2正交试验结果
表5
优化水解条件的L 9(34) 正交试验设计方案与结果Table 5. Results of L 9(34) orthogonal test
试验号123456789K 1j K 2j K 3j k 1j k 2j k 3j W 1W 2W 3R
A 底物浓度/B 酶浓度/
(mg ·mL -1)%
[***********]32.6824.4819.5810.898.166.532.36-0.37-24.73
0.51.01.50.51.01.50.51.01.519.7227.0629.966.579.029.99-1.960.491.463.91
C pH 值1.21.41.61.41.61.21.61.21.424.6225.0227.108.218.349.03-0.32-0.19-0.51.01
D 水解
温度/℃[***********]24.2026.2426.308.078.758.77-0.460.220.240.92
水解度/%8.1611.4213.106.268.709.525.306.947.348.53
Table 6. Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree 项目DH/%收集编号
由表6可以看出,水解度随水解时间的延长而增加,参考理想水解度14%,把水解时间控制为3.5h ,水解度控制到14.15%。所以从0.5h~3.5h以0.5h 为间隔,制备样品一组7个。
本部分试验对胃蛋白酶水解酪蛋白的酶促动力学进行了较为详细的研究,制备样品一组7个可以结合后面的Sephadex G-15的分离和色谱检测进一步开展试验确立胃蛋白酶酶解酪蛋白制备酪啡肽的最佳生成条件[5-6]。参考文献:
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水解时间固定为2h ,以底物浓度、酶浓度、pH 值、水解
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小常识
天气转暖食用发酵豆制品警惕肉毒素中毒
随着天气逐渐转暖,已进入肉毒杆菌中毒的高发季节。食用发酵豆类、面酱等食品时,应注意加热灭菌;食用罐头食据介绍,肉毒杆菌中毒是因为人们食入含有肉毒杆菌毒素的食品而发生的中毒。我国北方地区冬春寒冷缺菜,民间有制作
品、火腿、腌腊食品应进行仔细检查,如罐头顶部膨隆,食品的色、味、香有改变,或食品呈乳酪样酸臭时,应禁止食用。和食用发酵豆制品的习惯,每年这个时节,都会有一些因食用豆豉、豆瓣酱、臭豆腐、西红柿酱等食物引发肉毒素中毒的事件。
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