一种丝状真菌活细胞生物量测定方法的研究
药 物 生 物 技 术
40Pharmaceutical Biotechnology 2006, 13(1) :040～044
一种丝状真菌活细胞生物量测定方法的研究
刘伯宁, 乔长晟, 贾士儒3
(天津科技大学生化工程研究室, 天津300222)
3
摘 要 研究了一种基于测定脱氢酶活(D HA ) 的生化方法, 用以测定真菌活细胞生物量和评价菌丝活力。四唑盐(T TC ) 在活细胞体内经脱氢酶还原生成红色甲臜(TF ) 。以氢化可的松生产菌株coerulea 为模
) 、式菌, 通过优化染色时间(60min ) 、温度(45℃p H 值8. 0, 相关(r2=0. 98) , 验证了该方法的有效性。另外, , 体活力。
关键词 丝状真菌; 活力; ; 中图分类号:Q55:100528915(2006) 0120040205
。
但是, 目前缺乏有效的方法测定其活细胞生物量和评价菌丝体活力。丝状真菌在液体培养过程中, 菌丝易缠绕形成菌丝球, 造成培养液不均一。以氢化可的松生产菌株蓝色犁头霉(A basi di a coerulea , Ac ) 为例, 培养过程中菌丝球形态变化较大。传统的活菌计数法如:血球板计数法、平皿菌落计数法和M PN 法等, 均不适用于测定其活细胞生物量。目前, 发酵过程中生物量的测定, 多采用菌体干重或湿重法。菌体重量可以体现发酵液中生物质的多少, 但不能反映菌丝生理状态, 衰老程度, 甚至不能区分细胞死活。微生物发酵工业要求生产菌株有足够的活细胞生物量(或转化活性) , 才能实现产物的大量积累。这样, 菌体重量作为发酵过程的控制参数, 意义有限。建立一种能够快速测定真菌活细胞生物量, 有效评价菌丝体活性的检测方法, 对于更好的控制发酵过程显得十分重要。
从真菌生理代谢的角度出发, 物质代谢和能量代谢密切相关。能量代谢的关键是细胞中有机物氧化分解产生氢, 经呼吸链氧化释放能量。脱氢酶是呼吸链的主干酶系, 它们可以把基质氧化脱下的氢, 交给呼吸链传递释放出能量, 用于生物合成和维持细胞的生命活动。因此测定真菌体内脱氢酶活, 可以表征菌丝的生理活性, 反映被测样品中的活细胞生物量。
3收稿日期:2005206210 修回日期:2005209205
测定细胞内脱氢酶活通常使用四唑盐系列化
合物(T TC 、M T T 、IN T 和XT T ) 。无色T TC (2, 3,52氯化三苯基四唑) 作为人造受氢体, 它在细胞呼吸过程中接受氢, 还原成三苯基甲臜(TF ) 。后者以红色晶体的形式存在于细胞内, 采用有机溶剂(如甲苯、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮或乙醇等) 进行萃取。萃取液测定吸光度后, 根据标准曲线计算TF 生成量, 进而求出T TC 2脱氢酶活性(T TC 2D HA ) [1]。1 材料与方法1. 1 材料
1. 1. 1 菌种 蓝色犁头霉(Abasidia coerulea ) AS365, 本研究室保藏菌种。
1. 1. 2 培养基 斜面培养基:PDA 培养基
液体培养基(g/L ) :葡萄糖15, 酵母膏2. 7, 玉
米浆10, 硫酸铵6,p H 值6. 4～6. 71. 1. 3 菌体的培养与收集 活化后的蓝色犁头霉菌株AS365, 制成浓度为107～108/ml 的孢子悬浮液, 以5%的接种量接种到装液量为50ml 的250ml 锥形瓶中。28℃,160r/m 培养24h , 培养液0. 08M Pa 真空抽滤10min , 无菌水洗涤3次收集菌体。取上述收集的部分菌体, 121℃灭菌20min , 灭活菌体用滤纸吸去水分后备用。1. 1. 4 仪器 日本岛津UV 22401PC 型分光光
作者简介:刘伯宁,1978年生, 男, 河北省人, 在读硕士研究生
3通讯作者:贾士儒, Tel :[1**********]2, E 2mail :shrjia @public. tpt. tj. cn
度计。1. 2 方 法
1. 2. 1 TTC 工作液的配制 称取25mg 烘干的TTC 置于25ml 容量瓶中, 加蒸馏水定容至刻度, 作为TTC 母液(1mg/ml ) 备用。将TTC 母液稀释成浓度为10,20,30,40,50,60μg/ml TTC 工作液。1. 2. 2 TF 标准曲线的制定 取1ml 不同浓度的T TC 工作液(对照为1ml 蒸馏水) , 加入1ml 20%Na2S [2]新配溶液, 摇匀。反应1h 后, 各管分别加
测量菌丝体脱氢酶比活力。2 结 果
2. 1 TF 最大吸收波长的确定
T TC 经还原后形成的显色物质为红色晶体甲
入8ml 丙酮溶解TF 。反应液在485nm 处, 测定吸光度, 绘制标准曲线, 并求出TF 摩尔消光系数1. 2. 3 公式计算 在最适条件下1的T TC 转化为TF 单位(=1012p Kat ) T TC 脱氢酶量为T TC 脱氢酶比活力(Specific D HA ) 。
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D H A =(γ×V ×10) /(E ×60) D HA :脱氢酶活(p Kat )
γ:T TC 还原反应初速度(A/min )
V :TF 萃取液体积(ml )
E :TF 摩尔消光系数[L/(molocm ) ]
S peci f ic D H A =D H A /w Specific D HA :脱
臜(TF ) , 它可以被有机溶剂从细胞中萃取出来。80%丙酮与其他有机溶剂相比, 对TF 萃取效果好, 而且利于颜色稳定[3]Na2S 还原T TC TF , %丙酮后, 在375～可知, TF 最大吸收TF 的检测波长为
Fig 1 The determination of TL absorption maximum wavelength for measurement of T TC 2D HA
氢酶比活力(p Kat/g )
D HA :脱氢酶活(p Kat ) w :菌体湿重(g )
1. 2. 4 测定方法的优化 称取0. 1g 湿菌体, 加
2. 2 工作曲线的制定
按方法1. 2. 1绘制TF 标准曲线(见图2) , 线形
回归得到下式:y =0. 0204x , r 2=0. 9978其中y 为OD485, x 为相应TTC 工作液浓度。由此可知, 在
入3ml 0. 5%T TC 2PBS (p H 值7. 5) 染色液, 恒温水浴染色一定时间, 迅速加入0. 5ml 甲醛[3]终止酶促反应。离心收集菌体, 经无菌水洗涤后, 转移至比色管中, 加入80%丙酮溶液[3]室温萃取2h 。萃取液485nm 下比色, 记录吸光度。按方法1. 3. 2, 计算菌体脱氢酶活(D HA ) 。
1. 2. 5 测定方法的验证 分别称取湿菌体0. 02,0. 04,0. 06,0. 08,0. 1g , 依次加入高温灭
相当于10～60μg/ml TTC 浓度范围内, 吸光度与产物TF 浓度符合朗比定律。并依此计算出
:
活的菌体, 使每个样品总重为0. 1g , 使用优化后的D HA 法(结果2. 6) , 测定吸收度。考察吸光度值与活菌湿重之间的线形关系。每个梯度做5个平行样, 并计算平行样间相对偏差, 考察该方法的精确性。1. 2. 6 蓝色犁头霉不同生长时期脱氢酶比活力变化 活化后的蓝色犁头霉菌株AS365, 制成浓度为5×106/ml 的孢子悬浮液, 照方法1. 1. 3培养菌体。每6h 测定菌体干重, 绘制生长曲线。并同步
Fig 2 The standard curve of TF for measurement of T TC 2D HA
吸光系数a =A 485/(b ・c ) =20. 4L/(gocm ) b :吸收池光程1cm c :T TC 浓度(g/L )
摩尔消光系数E =Moa =334. 8×20. 4=6829. 92L/(molocm )
M :T TC 分子质量334. 82. 3 显色时间的确定
使用p H 值7. 5的0. 5%T TC 2PBS 染色液, 在30℃恒温下染色不同时间(结果见图3) 。在4h 内, 萃取液吸光度随染色时间延长而变大。其反应速率在2h 内维持不变(0. 0219,0. 0222,0. 0216, 0. 0217A485/min ) 。2h 后反应速率开始下降。本文确定染色时间为60min 。这样, 既保证所测得的反应速度为酶促反应初速度, 一定的吸光度,
4 The on measurement of
Fig 3 Determination of incubation time for measurement of T TC 2D HA
Fig 5 The effect of p H on measurement of T TC 2D HA
T TC 2D HA 酶促反应的最适反应环境为p H8. 0的PBS 缓冲盐液溶液。当反应体系p H 值
2. 4 反应温度的确定
四唑盐法测定微生物体内脱氢酶活的染色温
[4,5]
度多为37℃, 这既不是真菌的最适生长温度, 也不是脱氢酶酶促反应的最适温度。因此有必要针对染色温度进行优化。使用p H 值7. 5的0. 5%T TC 2PBS 染色液, 不同温度下染色60min (结果见Fig 4) 。对于Abasidia coerulea 体内的脱氢酶, 最适酶促反应温度为45℃, 本文以此作为最适染色温度。需要指出的是, 这与Abasidia coerulea 的最适生长温度28℃并不相同。2. 5 最适缓冲盐溶液及酸度的确定酶促反应体系的酸度、缓冲溶液本身性质以及缓冲容量, 对于酶活测定过程影响很大。D HA 法中常使用两种缓冲盐溶液Tris 2HCl [2～4]和PBS [6]。使用不同P H 值的PBS 、Tris 2HCl 缓冲液配制T TC 染色液, 在45℃恒温下染色60min , 测定菌体脱氢酶活(结果见图5)
。
低于7. 0时, 酶活显著降低, 不利于测定。p H 值在7. 5～8. 5时, 脱氢酶活可以维持较高水平。另外, 不同缓冲盐溶液本身的性质对酶活测定也有影响, 同样p H 值的PBS 缓冲液染色效果优于Tris 2HCl 缓冲液。因此T TC 染色液有必要使用p H 值8. 0的PBS 缓冲液配制。2. 6 优化后的D HA 法以蓝色犁头霉为模式菌优化后的D HA 法如下:称取湿重为0. 1g 的菌体, 置于10ml 离心管中。加入3ml 0. 5%T TC 2PBS (p H8. 0) 染色液, 45℃恒温水浴染色60min , 迅速加入0. 5ml 甲醛终止酶促反应。离心收集菌体, 弃去上清液。菌体经无菌水洗涤后, 转移至比色管中, 加入80%丙酮溶液25ml , 室温萃取2h 。萃取液485nm 处测定吸光度。对照图6. 以吸光度表征样品中活细胞生物量, 并计算菌体脱氢酶比活。以此作为评价真菌菌丝、菌丝球活力的指标。
而在实践中, 后者对于指导微生物发酵过程控制更有意义。蓝色犁头霉发酵生产氢化可的松过程中, 根据D HA 法所测生产菌株的活力, 对发酵参数进行优化收到很好的效果[7]。3 讨 论
在目前常用的微生物生物量检测方法中, 传统的平板计数法, Fig 6 Validation of the T TC 2D HA assay
2. 7 验证试验
应用本文2. 6所述的方法, 同的活菌、死菌混合物示, 优化后的D HA , 0. ～0. 1g 的范围内, (r 2=0. 98) , 吸光度能够很好的反映被测样品中的活细胞生物量。同时, 平行样相对偏差较小(
脱氢酶比活力高的菌体代谢旺盛, 生命力强。图7. 表明, Abasidia coerulea 处于对数生长期(18～30h ) 和刚进入稳定期(36～42h ) 时, 细胞代谢旺盛, 体内脱氢酶比活力较高。稳定期后期(48～72h ) 干重法测得数据显示, 菌体生物量虽能维持较高水平。但此时脱氢酶比活力急剧下降, 细胞开始大量衰亡。此时, 菌体干重已不能准确反映培养液中的活细胞生物量。
生长情况; 自动菌数测定仪, ; 比浊法受培养, 而且要求菌体沉降不能太, 由于培养过程中易形成菌丝球, 所以以上方法均不适用, 而干重法测定生物量, 不能区分细胞的死活, 难以评价菌丝球的活性。通过T TC 测定脱氢酶酶活的方法, 可以很好的解决这一问题。该方法不仅能够区分出死细胞与活细胞, 而且处于不同生长时期的细胞, 其活性的差异可以通过脱氢酶比活力体现出来。从这一点上说,D HA 法较传统的湿重, 干重法, 更能反映菌体的真实生长情况。
作为一种用于测定真菌生物量的新方法, 通过四唑盐系列化合物测定脱氢酶活, 可以应用于真菌孢子活性[1]和细菌[5], 酵母菌[8]中活细胞数量的测定。而且, T TC 作为活体染色剂, 能够使绝大多数真菌活细胞显色。这表明, 只要针对研究对象对现有方法进行一定优化, 该方法可以快速, 有效的测定丝状真菌活细胞生物量, 满足发酵过程中对菌株生理状态监测的要求。
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通过D HA 法与传统的真菌生物量测定方法2干重法的比较。可以看出, 菌体干重只能体现培养液中生物质总量的多少(包括衰老、死亡的细胞) ; 而D HA 法测定结果(脱氢酶比活力) 则可以反映细胞处于不同生长时期时的生理状态、活力差异。
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(B iochemist ry Engi neeri ng L aboratory ,
Ti anj i n U ni versit y of
S cience
&Technolog y ,
Ti anj i n
300222, Chi na )
Abstract A biochemical met hod , based on () , has been devel 2oped for measuring viable cell ungal mycelium. In t he viable cell , a tet razium salt (T TC ) is ) using celluar dehydrogenase. The procedure of t he colorimet ric by using hydrocortisone 2producing st rain Abasidia co 2erulea as a model. of t he met hod has been considerably increased by determining t he opti 2) and p H value (8. 0) . The mal reactio n conditions including incubation time (60min ) , temperat ure (45℃
validity of assay is p roved by a correlation established between A 485and t he wet weight of viable myceli 2um (r 2=0. 98) . Moveover , Applying t he optimized p rocedure t he specific D HA can be used for assessing t he viability of f ungi accurately
K ey w ords Filamentous f ungi , Viability , Tet razolium salt s , Dehydrogenase activtity , Abasidia coerulea
(上接第27页)
Studies on Stability and Anticancer Activities of Meret rix meret rix
G lycopeptide MGP0405
ZHAN G Bo , WU Wu 2tong , WU Jie 2lian
(S chool of li f e science and technolog y , Chi na Pharm aceutical U ni versit y , N anj i ng , 210009)
Abstract To investigate t he anticancer activity of Meret ri x meret ri x Glycopeptide M GP0405. M GP0405was isolated f rom ext ract s of Meret ri x meret ri x by ultrafilt ration and p urified on adsorption chromatog 2rap hy and gel filt ration chromatograp hy. M GP0405was stable below 30℃and in neut ral solutio n. The anticancer activities of M GP0405in vitro were evaluated by M T T assay. M GP0405showed different de 2grees of inhibitory activity on t he growt h of eight human cancer cell lines , in which K B cell line was mo st st ro ngly inhibited. Furt hermore t he anti 2adhesive attraction activity of M GP0405was also found. The antit umor activity in vivo showed t hat M P G0405could st rongly inhibit t he growt h of S180t umor. K ey w ords M eret ri x meret ri x L i nnaeus , Glycopeptide , Anticancer