中药药理研究方法简介

中西医结合专业研究生班讲座

题目：中药药理研究方法简介

中药现代化研究是离不开药理学的研究方法，而药理学的研究方法又主要借助于生理学、生化学、免疫学、分子生物学和形态学的方法和手段逐渐发展起来。在中药药理研究过程中，方法的选择是至关重要的，而中医中药的研究又有其独特的方面，即中医的病症与现代医学研究采用的模型是否吻合，用现代医学研究的方法和手段能否反映出中医中药研究的特色，这是多年来中西医研究过程中一直在探讨和需要解决的问题。下面仅从几个方面粗浅地介绍药理学研究过程中的一些常用的方法和手段，旨在为中医中药的研究提供参考。

一、          概 述

（一）基本研究方法

1. 离体实验（体外实验）

（1）离体器官：心脏、子宫、肠管、气管、血管条、神经等；

（2）离体组织：脑组织（海马脑片培养）、肝组织培养；

（3） 体外培养细胞：血细胞、心肌细胞、脑细胞、胶原细胞、肿瘤细胞、试管内或培养基内的细菌和病毒等；

（4）体外实验的优点：实验重复性好，用药量少（适合于提取合成的药物），节省动物，效果直观，主要用于药物作用机制的分析；

（5）体外实验的不足：实验条件要求严格，结果易受药物中的杂质和理化性质的影响，有时与整体实验的结果不符合。

2.      整体实验：包括正常动物和病理模型。

（1）正常动物实验：观察在正常机体机能状态下，药物产生的影响。如药物对正常动物血压的影响，对动物行为活动的影响。又分为急性实验（短期内如一次给药或连续3~7天给药）和慢性实验，如药物长期毒性测定，药物延长寿命实验等。

药物对正常动物产生的作用只能说明药物作用的趋势，并不能完全说明药物就对该系统的疾病状态产生治疗作用。

（2）动物的病理模型

l 模型的制造：  肾虚模型  高血脂模型  高血压模型   心肌缺血模型

痴呆模型     抑郁模型

l 模型的特异性：制造的模型是否与临床疾病的病理、病理生理过程吻合，有效的

治疗药物能否改善模型的某些症状，药物在模型上的治疗作用能否在病人身上同样有治疗作用。如用于抑郁和抗抑郁药研究的抑郁动物模型。

l 模型的选择：根据研究的目的和要解决的问题有针对性的选择模型。如补肾壮阳

药要选择肾虚模型，要观察药物对动物耐力的影响；益智药研究要选择呆傻的动物模型（认知、记忆和巩固的不同阶段观察药物的作用）等。

（二）研究题目的选择：

中医学理论渊博久远，中药资源是我国的宝库，具有广大的研究潜力，作为研究生如何在有限的时间内选准题目，进行有意义的研究。下面仅就中药研究方面提出几点想法。

1.      寻找秘方、验方，进一步发掘；

2.      在验方的基础上，重新组方；

3.      开拓秘方、验方新的适应症；

4.      单味药有效部位、有效成分的研究；

5.      中药复方和单方制剂的研究。

（三）实验设计

1. 建立实验假象

2.      根据实验目的，确定实验动物、观测指标、动物模型

动物的选择：注意动物对药物反应的特异性

（1）观测指标：客观性和可测量性（定量或定性）

（2）动物模型：除观测药物对正常动物的影响外，还要在疾病的动物模型上进行研究，如降压药（正常动物，肾性高血压模型，自发性高血压模型）

3.      剂型、剂量、给药途径和给药时间

（1）剂型：选择剂型的原则是在保证药物活性不变的情况下，选择便于保存、携带、用药和充分发挥药效的剂型，同时注意中药的特点。

（2）剂量：实验研究所用剂量的确定主要根据药物的LD50。如果实验药物分为3个剂量组，则高剂量组是1/10 LD50,  中剂量组是1/30LD50，低剂量组是1/90LD50；如果研究用药的LD50测不出来的话，根据临床用药量按体表面积进行换算。

（3）给药时间：根据临床用药的经验和研究的目的决定

实验用药每天给药的次数和天数。

（4）给药途径：与临床给药途径相一致。

4. 实验分组：  空白对照组

模型对照组

阳性药物对照组

实验用药组

每组动物所用的例数根据实验设计的要求而定。

5. 实验设计的基本原则：

（1）重复

（2）随机

（3）对照：组间对照

自身对照

配对对照

（四）实验结果的处理和分析

1. 结果正确性的判断：实验条件控制的严密性，实验数据的客观性，技术上有无问题，实验设计上有无漏洞（慎密的实验设计是非常重要的）等。

2.      结果的统计学处理：根据实验资料选择不同的处理方法。注意的问题是：

（1）不要随意抛弃数据，如偏差过大的数据（超过3个SD）可废弃不用。

（2）注意有效数字和误差之间的关系：测量所得数字的位数，用来表示测量的精密度如：

a. 2.5~3.5

3.0       2.95~3.0

3.00      2.99~3.00

0.001 是1位有效数

0.0025 是2位有效数

b. 应用百分数时要注意：

（a）分母不能太小，如1/3不等于33.3%；1/5不等于20%。

（b） 测得20只动物死亡率是50%，10只动物死亡率是10%，100只死亡率是5%，不等于50%+10%+5%/3 =21.7%，而是50%x20+10%x10+5%x100/20+10+100=12.6%。

（c）A组死亡率是90%， B组死亡率是30%；错误的比较是 A/B=3倍，B/A=1/3倍；正确是A-B=60%。

3.      数据的表达：

（1）表格

（2）线条图

（3）照片

（五）影响实验的因素

1. 动物因素：

（1）种属差异：包括量和质的差异，如巴比妥类药物对不同种属动物催眠时间的差异；组胺可使猫、狗血压下降，而使兔血压升高，豚鼠支气管收缩，回肠平滑肌兴奋增高。酒石酸锑钾可使狗、猫、鸽子呕吐，但兔和大鼠不吐。兔对阿托品类降压不敏感（体内代谢快）。

（2）性别差异：不同性别大鼠对有机磷毒性反应不同，对环己巴比妥的催眠时间有差异。所以，实验时要雌雄均用。

2.      环境因素：不同温度氯丙嗪的 LD50不同（低温或高温时，LD50小，毒性大）；苯

丙胺在高温时死亡率高；一只笼子放1只鼠死亡慢，放5只鼠死亡快。不同季节蛙对洋地黄的最小致死量不同；食物中含二甲基硫胺、苯吡喃酮不同，小鼠肿瘤发生率不同。

3.      药物因素：药物的溶解度、吸收情况、给药途径、试剂是否标准等。实验中的误差

主要来自系统误差如天平称量不准，不同天平精密度不同，量筒和滴定管的差异等。称量药物量越少，误差越大；溶液稀释时，一次稀释误差小，稀释多次误差大。

二、药理实验常用的方法介绍

（一）心血管药物的实验方法

1. 强心作用药物的实验方法

（1）了解心衰时病理生理变化：

◇ 心肌收缩力减弱

◇ 心脏负荷增加

◇ 神经体液调节失常

◇ 心肌肥厚

（2）在体心脏方法：

△ 心肌收缩力的测定：动物选用犬、猫或兔，麻醉、固定、开胸手术，暴露心脏，于右肺动脉根部及左心尖处各逢一线，连于心脏描记器，记录心肌收缩曲线。6%戊巴比妥钠（约20-60mg/kg）静脉注入，造成心衰。然后，给予所试药物，测定有无强心作用。

△ 心脏血流动力学测定：动物方法同上。心脏暴露后，于心尖部插入一导管，测

定心室内压；分离主动脉根部和左冠状动脉，测定主动脉流量和冠脉流量；及分离股动静脉，测定血压、给药和动静脉氧含量。

观测指标：LVDP, LVEDP, ±dp/dp（max）, 心脏指数，心博指数，血压，平均动脉压，心肌耗氧指数等。

△ 心肌组织学检查：取衰竭心脏和治疗后心脏做组织学检查，观察药物对心肌结

构的影响。

（3）离体心脏实验：

△ 离体蛙心实验

△ 离体心肌实验：取猫、豚鼠、兔、狗的乳头肌放入充满K-H液的浴槽中，通氧，描记收缩曲线，比较给药前、后的收缩幅度。

△ 体外培养心肌细胞实验：取乳鼠心室肌，剪碎，胰蛋白酶消化成单细胞，培养48小时，镜下观察和比较给药前后不同时间细胞搏动的情况。

△ 心肌细胞酶实验：测定ATP酶的活性。

2. 抗高血压药物实验方法

降压药与抗高血压药的区别：有降压作用的药物并不一定能用于治疗高血压，如氨茶碱；酚妥拉明能够扩张血管，但不一定降压。

（1）根据高血压发生的机制，药物选择的作用靶点：

△ 减少血容量

△ 降低交感神经的张力

△ 扩张血管

△ 抑制血管紧张素转换酶

（2）药物对正常动物（清醒或麻醉）和离体血管条的作用：从实验结果中推测药物是否具有降低血压的趋势。

（3）药物对实验性高血压模型的降压作用：

△ 神经原性高血压模型（Neurogenic hypertension）

a. 刺激高级神经中枢：紧张性劳累性精神刺激（电、化学、物理刺激）；

b.      切除颈动脉窦、主动脉弓减压神经；

c.      损伤延脑孤束核：手术机械损伤或给予强烈的电刺激或化学损伤（6-羟多巴胺）

d.      注射胶体于硬脑膜腔内，使脑压升高；

e.      向脑室内注入药物，如血管紧张素

△ 肾性高血压模型（Renal hypertension）

利用结扎法、夹住法或一侧切除法形成慢性单肾或慢性双肾肾性高血压，然后评价药物的作用。该模型主要反映高肾素型高血压。

△ 盐皮质激素性高血压模型（Hormonal hypertension, DOCA）

盐皮质激素具有保钠、保水，增加血容量，升高血压；同时，又使得中枢α2受体活性降低，而发生高血压。在评价药物时可与慢性肾性高血压模型配合。

△ 高盐性高血压（Hypertension with high salt intake）

形成机制：血容量增加；血管反应性改变，对内源性血管活性物质反应性增高，而发生高血压。

△ 自发性高血压大鼠模型（Spontaneous hypertension rat, SHR ）

将高血压大鼠近亲交配可获得SHR。SHR大鼠成功率雄性90%，雌性58%。

SHR亚型：

肥胖型高血压：SHR+高血脂

动脉粥样硬化型高血压：SHR+高胆固醇

卒中型高血压：SHR+脑症状

（4）抗高血压药降压机制分析

△ 离体实验

△ 血管平滑肌细胞培养，测定对各种离子的影响

△ 对交感神经放电的影响

△ 对内源性血管活性物质的影响

3. 抗心律失常药动物实验

（1）动物选择：

△ 种类：除离体蛙心外，不选择冷血动物；大动物与小动物的区别，小动物（鼠、兔、豚鼠、猫）形成室颤时心脏可以自行恢复（环行传导通路短，当冲动落在不应期时可以消失），而大动物（狗、猴、猪）则不易自行恢复。小鼠和大鼠对诱导心律失常药物哇巴因不敏感，而豚鼠对其敏感（几千倍），猫、狗、猪敏感，与人相似。

△ 标本：离体心脏，离体心房、心室乳头肌、心肌细胞等。

△ 给药方法及评价：大鼠心跳300-400次/分，小鼠心跳400-600次/分，兔心跳200-300次/分，猫、狗心跳100多次/分，以心电图二导联记录心电变化评价药物的作用。

治疗给药（自身对照）：在心律失常时给药；

预防给药（组间对照，口服给药多在1小时前，静注时1-5分钟可立即给药）：比较心律失常持续时间、程度。

（2）实验方法：

◇电刺激法：

a.      整体实验：麻醉动物（猫、兔），给予适当的电刺激，引起可逆性心律失常（对

心脏几无损伤）。

方法：电极放置在主动脉处，形成心房心律失常；电极放在心室上，引起室性心律失常。根据刺激强度控制心律失常的程度，一般以房颤、室颤为指标，找出给药前阈值，给药后再找出阈值，进行阈值比较。阈值多为2-3次的均和，每隔3分钟刺激一次，给药后10~15分再重复刺激。

b.      离体标本：将电极放置心脏表面，找出给药前后最大耐受，比较给药前后的变化。

（也可测定REP）

◇冠状动脉结扎法：

a. 动物：狗、猫、兔、大鼠

b.      部位：冠脉左前降枝，结扎部位不同，死亡率不同

c.      结扎方法：二期结扎法，首先不扎实，促进侧枝循环代偿，30分钟后再扎实，

可降低死亡率。结扎后5-7小时可出现室性早博到室速；10-36小时可以进行实验。

d. 原理：结扎后→心肌缺血→兴奋性增高→异位节律

→心肌损伤→释放出K+→对心肌产生抑制

↓

上述作用使得心肌不协调，加重心律失常

e. 缺点：对利多卡因效果差。

◇化学物质引起的心律失常：

a. 氯仿（CHCl3）：主要作为药物的筛选。动物为小鼠，吸入氯仿3-5分钟，呼吸

停止，取出心脏，可见心室纤颤。利多卡因、苯妥因钠效果差，而其它药物多有效。发生的机制认为与植物神经系统、肾上腺髓质有关。

b.      肾上腺素：兔，静脉快注肾上腺素（10-100μg/kg），但形成心律失常持续时

间短，约2-5分钟，多出现室早、室速和室颤。此法的优点是可反复给药，每隔1小时重复，自身对照，并可观察抗心律失常药作用持续的时间，心得安效果最好。

c.      乌头碱（Aconitine）：与热不稳定，容易被破坏。局部用药（浓缩后滴在心

脏上或以结晶放在心脏上）引起房性心律失常；全身静脉给药（20-30μg/kg,股静脉或舌静脉给药）引起室性心律失常（Vp→Vt→Vf）。大鼠、豚鼠、兔出现心律失常可维持40-60分钟，室速可维持60分钟以上或2-3小时以上。主要影响0相动作电位促进Na+内流，又叫Na+通道开放剂。

d. 氯化钡（Bacl2）：动物选择大鼠或兔。大鼠多以乌拉坦麻醉，给予氯化钡

5mg/kg；兔多以水合氯醛麻醉（300mg/kg,ip），给予氯化钡4mg/kg，水合氯醛可协助氯化钡产生心律失常。氯化钡多引起室性心律失常，可持续15分钟。发生机制：Ba与Ca相似，过量引起兴奋；Ba加快0相除极速率，并开放Na通道；与交感神经兴奋有关。抗心律失常药均可对抗Ba引起的心律失常。

e. 氯化钙：普氏纤维对Ca敏感，而当心肌兴奋时，普氏纤维则又抑制，使得心

脏跳动不协调、分离，而发生心律失常；同时，Ca又兴奋交感神经。可引起室性心律失常，但剂量难以控制，Vt与Vf剂量范围小。观察指标：是否出现心律失常，Vf或死亡，然后进行比较。

f.       哇巴因：引起心律失常出现快，多用犬、猫、豚鼠，静脉给药。给药原则是

先iv临界量，然后每隔3分钟注入一定量，直到心律失常。记录：Vp出现的时间、容量；Vt时间、容量；Vf时间、容量；死亡时间、容量。对照组与给药组分别以时间、容量进行比较。

4. 抗心肌缺血实验

心肌梗塞病理模型是研究心肌缺血的一种方法,作为筛选抗心肌缺血药物有如下规程。

(1) 药物筛选过程：

l 小鼠常压或低压耐缺氧实验

a.      测氧仪测定动物死亡时氧余存量或不同时间耗氧速率

b.      对抗异丙肾上腺素增加心肌耗氧量的作用比较

c.      生化指标：心、脑乳酸和糖原含量

l 对抗垂体后叶素引起的心电图缺血改变

l 制造犬心肌缺血病理模型

(2) 动物：

l 犬：优点：解剖特点类似于人的解剖

犬的心脏占犬体重比例大

犬的冠脉清楚，易于操作

抗心律紊乱能力强

缺点：犬心侧枝循环丰富，如果条件不恒定会影响实验结果。

l 猫、大鼠：价格便宜，但心律紊乱后易引起死亡。

l 兔：冠脉变异大，结果不一致。

（3）心脏冠脉解剖学特点：

冠脉分为：

右冠脉

左冠脉：左旋枝

左前降枝(LAD)：供给左、右心室的一部分和室间隔2/3的血供，结扎LAD可致左心室前壁心肌梗死。

（4）方法：

◇ 结扎法：

l  结扎部位：    a. LAD上1/3处

b. LAD的中点

c. LAD的下1/3

d. LAD和左旋枝的分支均结扎

e. LAD的1/2和大的侧枝结扎（优点：梗死范围清楚、恒定；要

求：LAD全长>6cm,大斜支>4cm）

l  二步结扎法：以5-51/2的针头插入动脉内结扎，30分钟后拔出针头，全扎。可防

止心肌突然缺血，发生心律紊乱。

l  一步结扎法：结扎前iv利多卡因8mg/kg，预防心律紊乱。

l  心导管插入法：在心尖部做一荷包式缝合，用针将心肌穿透，插入心导管于心室

内，导管内放入NS+肝素（1mg/ml）；另一端接换能器，测定心室内压。

l  观察指标：

缺血程度：∑ST和NST（范围）

缺血范围：N-BT染色（氯化硝基四氮唑兰）

心外膜心电图：S-T段抬高反映心外膜缺血

S-T段下移反映心内膜缺血

S-T段在6-7小时后恢复正常，故药物应在1/2-1小时内给予，避免假阳性。

血液动力学：a. BP(mBP)

b. HR

c.心肌耗氧指数=mBP x HR

d.左心室内压：LVPSP（收缩峰压）反映心肌收缩力

LVEDP（舒张末期压）反映心肌灌流状况

生化指标：测定乳酸、GOT（谷草）、CPK（磷酸激酶）等酶的活性和O2、CO2。酶的活性增高与心肌梗塞的范围是呈正比。

心梗范围（MIS）：作为药物是否有抗心肌缺血的主要指标。

a.      国外在犬的心外膜上放置许多电极，以ST升高的个数作为梗塞范围；

b.      CPK曲线（数学推导）

c.      组织化学染色法（N-BT染色）：非缺血区呈深蓝黑色，缺血区呈灰白色，剪下缺血片称重/左心室重量x100%，表示梗塞范围。

l  整个实验过程：

a.      选狗：强壮、毛光亮，10kg以上，X光、心电图检查。

b.      麻醉：戊巴比妥钠25-30mg/kg

c.      气管插管

d.      左侧第5肋间开胸

e.      结扎后观察24小时，然后取出心脏。

◇ 阻塞法：气囊阻塞，水银阻塞，微球法

◇ 药物模拟心肌缺血：

l  垂体后叶素：动物选用清醒状态大鼠。

垂体后叶素→冠脉、全身血管收缩→阻力增加→血压升高→心脏后负荷增加→心肌缺血

观察指标：ECG指标：J点，ST和T波变化

注意：动物对垂体的耐受性，恒速给药，同批药。

l 异丙肾上腺素、肾上腺素：增加心肌耗氧量，心肌缺血。

附表：

表1. 动物心率、P-R间期及Q-T间期

动物       心率（次 /分）          P-R间期（秒）       Q-T间期（秒）

猴        150－273（x＝215）      ♀0.079  ♂0.076     ♀0.21   ♂0.20

狗        100－240（x＝159）      0.07－0.11（x＝0.089） 0.16－0.2（x＝0.175）

兔        160-330                 0.06-0.08              0.144±0.0038

大鼠      x＝300                  0.042±0.0005

小鼠      x=400                   0.043±0.0004

表2. EKG的P波形态、时间及电压

动

物

时

间

（秒）

方向

电压

a   a  a  胸

Ⅰ Ⅱ Ⅲ  V   V  V  导

R   L  R  联

标准导联  肢体导联  胸导联

（mv）     (mv)      (mv)

猴

0.03～0.04

低 直 直 倒  倒  直 MV1-3

平 立 立 置  置  立 无倒置

或双相

0.12     向上0.10

向下0.08

狗

0.03~0.05

直 直 直 倒  倒  直 V1-3

立 立 立 置  置  立 直立

VR3-6

倒置

Ⅰ0.061  aVR0.122   V1 0.064

Ⅱ0.194  aVL0.052   V3 0.081

Ⅲ0.156  aVF0.151   V6 0.1121

VR3 0.061

兔

0.03

(0.02~0.04)

大 全 全 全  大  全

部 直 直 倒  部  直

直 立 立 置  直  立

立           立

Ⅰ0.03   aVL0.05

Ⅱ0.10   aVR0.06

Ⅲ0.008

鼠

直

立

大Ⅱ0.083±0.2

小Ⅱ0.0121±0.3

表3. QRS波群

动

物

时间（秒）

电压(mv)

标准导联

肢体导联          胸导联

猴

0.037

（0.035~0.041）

Q

R    0.61

S    0.25

0.41

0.41     Mv1  Mv2   Mv3

0.48   0.92   0.90

0.31     0.97   0.56   0.26

狗

0.0475

（0.04~0.06）

Ⅰ  Ⅱ   Ⅲ

Q 0.108 0.07 0.066

R 0.21 1.115 0.899

S  0  0.093 0.126

aVR   aVL  aVF  v1  v3    v6  vR3

0.657 0.348 0.068  0   0    0.043  0

0.350 0.139 0.952 0.813 1.236 1.07 0.414

0.612 0.30  0.115 0.589 0.39 0.193 0.68

兔

0.03

Q 0.01  0    0

R 0.13 0.35  0.33

S  0  0.09  0.11

0    0.04

0.16 0.14

0.22 0.20

小鼠

0.022

R   0.122

大鼠

0.023

R   0.363

S-T段：

猴：Ⅰ导等电线； Ⅱ导、Ⅲ导和aVF是等电线或降低，而aVL、aVR呈等电线或升高，

总平均偏移度为0.03mv左右；胸导联S—T 段均为下降，总偏移度0.08mv,呈斜

升型。

狗：90%为等电线，10%下降或上升，呈斜升型

兔：偏移较少，4%Ⅲ导、aVF降低0.05mv；2%Ⅰ导、aVL抬高0.05mv，一般不超过0.1mv。

鼠类：大、小鼠无明显S-T 段。

表4. T波

猴

波形

Ⅰ  Ⅱ   Ⅲ     aVR   aVL  aVF         Mv1  Mv2   Mv3

低  直   直     倒    倒   直           不    直     直

平  立   立     置    置   立           定    立     立

电压

0.17  0.17   0.13   0.13  0.14        0.11   0.35    0.35

狗

波形

Ⅰ  Ⅱ   Ⅲ     aVR   aVL  aVF        v1     v3    v5    vR3

低  直   直     倒    倒   直         直     直    直     直

平  立   立     置    置   立         立     立    立     立

电压

0.188 0.126  0.083  0.051  0.141      0.291  0.232  0.186  0.123

兔

波形

Ⅰ  Ⅱ   Ⅲ     aVR   aVL  aVF

直       直      倒    不   直

立       立      置    定   立

电压

变异较大，0.05-0.4mv。

鼠

较难测量

5. 降血脂动物实验：

（1）正常动物的初筛实验：

动物：大鼠、小鼠、鸡、兔等；

正常大鼠血清总胆固醇浓度约为：92.67±1.87mg%，若试验药物能降低大鼠血清总胆固醇20%，可认为有降胆固醇作用，值得进一步研究。

（2）高血脂症动物模型：

动物：大鼠

方法：高胆固醇饲料（1~4%胆固醇，10%猪油，0.2%甲基硫氧嘧啶，86~89%基础饲料）喂养，每天15~20g，持续2~4周，用于降血脂实验。

（3）高血脂及动脉粥样硬化模型

动物：兔

方法：兔对高胆固醇饲养非常敏感，短期内能诱发明显的病变。在饲料中加入高脂肪和高胆固醇后，主动脉斑块发生率达100%，大约6周可以形成，用于观察药物的作用。

测定指标：主动脉大体形态学观察

光镜下观察：内皮细胞增生肿胀，内皮下层增大和脂质沉着，并出现泡沫细胞。

电镜观察：内皮细胞的完整性；分析内皮细胞间隙的改变。

（4）动脉粥样硬化的生化测定

血清胆固醇、血脂蛋白、游离脂肪酸；

肝脂酶（HL）、脂蛋白脂酶（LPL）、卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）、HMG-CoA还原酶活性的测定；

脂质过氧化物（LPO）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性测定；

脂蛋白受体功能的测定：LDL受体的RIA测定。

（5）细胞培养实验

血管内皮细胞培养：观察内皮细胞形态，3H-TdR掺入测定，LDH测定。

（6）有关因子及基因表达实验

血小板源性生长因子（PDGF）及c-myc mRNA与蛋白表达

PDGF-B mRNA表达

（二）中枢神经药物实验方法

中枢神经有着庞大、复杂的结构特点和功能，如血脑屏障、各种结构不同功能各异的神经细胞、神经核团、脑区和多种神经递质的调节。因此，神经系统疾病和治疗药物的研究存在一定的困难，在药物研究过程中应该充分考虑到这些情况。下面仅就神经系统几种常见疾病的药物研究介绍一些方法。

1. 抗癫痫药物实验

（1）最大电休克发作实验（MES）

MES是癫痫大发作动物模型，受试药若能对抗MES，则该药在临床上可能对癫痫大发作有效。

l 动物：小鼠或大鼠

l 仪器：电惊厥仪，刺激电极（耳电极或角膜电极），刺激参数：小鼠电流50 mA，电压100v；大鼠电流150mA，电压180v；刺激时间0.2-0.3s。

l 观察指标：惊厥发展有四期，潜伏期、强直期、阵挛期、惊厥后期。以后肢强直性惊厥出现与否为准，若给药后此期不出现说明此药有抗MES作用。

（2）声源性发作法

某些敏感动物受到强的铃声刺激时，能产生一种定型的运动性发作，称为“声源性

发作，AS”。属于癫痫大发作模型。

l 动物：大鼠或小鼠, 一般需培育纯种AS阳性鼠，通过近亲交配，至少超过20代，

可得到纯种AS阳性鼠，达到50％以上（北京医科大学药理室培育的P77-PMC鼠）。

l 方法：选择声源性敏感的大鼠（铃声刺激60秒或90秒能产生奔跑或惊厥者），放

入声源性发作箱，箱内装有电铃，产生的音量约为110－120分贝。当给予铃声刺激时，动物便开始奔跑，倒地、抽搐、惊厥。AS反应强度分为5级：

1级 0分，阴性反应

2级 10分 奔跑一次

3级 20分 奔跑二次

4级 30分 奔跑一次，惊厥一次

5级 40分 奔跑二次，惊厥一次

（3）戊四唑惊厥法

戊四唑为中枢兴奋药，过量兴奋和脊髓，表现强烈的阵挛行惊厥，继续发展为强

直性惊厥。

l 戊四唑发作阈值试验（小发作模型）：小鼠，SC戊四唑85mg/kg，給药后5－15

分钟内发作，头部及前肢抽搐，但不影响翻正反射。每次可持续5－15秒，可反复发作，少数动物可转为强直性惊厥而死亡。药物能够防止发作，可视为有效。

l 戊四唑最大发作试验（大发作模型）：将0.5％戊四唑生理盐水，按38mg/kg于4

秒内尾静脉快速注射，动物即产生强直性惊厥或死亡。

（4）点燃效应模型

在脑内某些特定的区域受到经常的重复刺激，最终导致脑功能产生某种持久的变化，称为“点燃效应”。用低电压或小电流重复刺激大鼠的杏仁核，最终引起惊厥发作。目前是公认的做好的癫痫模型。

l 方法：大鼠麻醉。固定于立体定位仪，将电极埋藏于杏仁核。手术后大鼠休息一

周，然后进行点燃。刺激条件是方形波电压，波宽1毫秒，频率60赫兹，刺激持续时间为2秒，每天刺激一次，刺激时间最好相同。刺激电压从4伏特开始，每刺激2－3天后将电压升高1－2伏特，每次刺激后注意观察动物反应并做记录，记录内容包括：点燃日期、电压值、动物的表现等。动物如有静止不动、单侧或双侧闭眼、转头、转圈跑、嘴和面部肌的运动、点头、前肢阵挛、站立、摔倒等阳性结果。大鼠产生典型发作后，其发作阈值立即下降，此时每天减少次级电压，当降至某个电压值刚好引起最大发作，连续刺激3天，该电压的刺激既能得到稳定的点燃发作效应。此时可利用这个模型进行实验。

（5）机制分析方法

癫痫发作机制复杂，目前并不知道确切的机制。但与脑内神经递质、氨基酸、微量元素、神经细胞电活动异常、细胞信号传导紊乱有关。

l 测定脑内GABA和谷氨酸含量及其合成酶和代谢酶的活性；

l 测定脑内各种神经递质的水平；

l 测定cAMP/cGMP的水平；

l 测定脑神经细胞的电活动情况。

2. 镇痛药实验

（1）热板法

（2）扭体法（酒石酸锑钾，乙酸）

（3）光照刺激甩头法

3. 促智药和抗痴呆药研究

早老性痴呆症又称阿尔采默病（Alzheimer disease, AD），AD的临床症状主要是记忆障碍、认知功能缺失及痴呆。病理学特征是脑中发现老年斑（senile plaque）、神经纤维缠结（neurofibrillary tangles）及选择性神经元死亡。受影响的区域主要有大脑皮层、海马、杏仁核、基底前脑胆碱能系统及脑干单胺类神经核团。AD的病因至今还未有结论性阐明，目前研究认为主要是脑神经细胞退行性病变机制如氧化应激机制、线粒体机能障碍机制、兴奋性毒性机制、炎症机制及细胞凋亡机制等。它们之间相互影响，最终导致神经功能失调和细胞死亡。

（1）对早老性痴呆动物模型的实验研究：

l 对东莨菪碱、D-半乳糖诱致动物学习记忆障碍的影响

l 对结扎动物双侧颈总动脉诱致血管性痴呆的影响

l 对大鼠或小鼠脑缺血再灌注损伤致学习记忆障碍的影响

l 对大鼠海马内微量注射β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）建立的痴呆模型的作用

l 检测方法：采用小鼠穿梭实验，Morris水迷宫，跳台法，避暗法及自主活动的测定等方法。

（2）对神经细胞退行性改变的启动因子抑制作用的研究

l 对抗Aβ注射动物脑细胞凋亡的作用（观测指标：DNA电泳梯度形成，bcl-2表达下调，bax、P53、C-fox表达上调及APP过度表达等）

l 抗氧化应激作用（脑细胞内nNOS、LPO、SOD、GSH-px酶活性的测定和脂褐素的测定）

l 抗炎性细胞因子的作用（测定脑细胞内IL-1、IL-4和IL-6的变化）

（3）对AD发生相关酶活性的影响（检测脑细胞内Ach-E，MAO，Na+,K+-ATPase的活性）

（4）药物对脑组织核酸代谢的影响

（5）药物对脑海马细胞神经电活动的影响（采用膜片嵌技术）

4. 抗抑郁药研究方法：

（1）利血平拮抗：利血平耗竭脑内CA类递质（NA、Adr、DA和5-HT），引起动物行为和生理上的变化，表现为：眼睑下垂，体温下降及强直症状。药物能够改善或拮抗上述症状，可能具有改善抑郁的作用。

（2）“行为绝望”模型：将动物（大鼠或小鼠）放入一定水深的装置内，预试15min后，烤干，重新放入，测定动物在该装置内5min内漂浮不动的时间。评价药物对其改善作用。

（3）获得性无助模型：动物可选用大鼠，将动物置于无法逃避的应激刺激（如电击）时，将随后产生操作欠佳，而在同等的可以逃避的应激刺激下则不产生操作欠佳。抗抑郁药可以逆转。

（4）脑内神经递质变化的测定。

（三）平喘药物研究方法

1. 镇咳实验：采用豚鼠枸橼酸引咳法、猫二甲基苯基哌嗪引咳法，根据实验结果分析药物的镇咳作用。

2. 平喘实验：选择整体动物药物引喘法，即将引喘药物 0.1%组织胺和2%乙酰胆碱以气雾法给予豚鼠引起支气管痉挛、窒息，观察药物的支气管平滑肌松弛作用。

3. 祛痰实验： 小鼠腹腔注射0.25%苯酚红溶液 0.7ml/只，30分钟后将动物处死。分离气管，以5%碳酸氢钠冲洗3次（0.4ml/次），合并冲洗液进行比色，观察药物的祛痰作用。

（四）溃疡病药物研究方法

1. Shay幽门结扎型溃疡：结扎幽门造成胃液在胃中滞留，致溃疡因素增多，导致溃疡形成。以溃疡指数（根据溃疡面积确定）评价药物作用。

2. 应激型溃疡：应激刺激使中枢兴奋和抑制过程失调，植物神经紊乱，迷走张力过高，胃肌强烈收缩，压迫胃部血管，引起继发性粘膜血运障碍，形成溃疡。一般将大鼠放入冷水中（230C）浸泡7小时，处死动物，取出胃，测定溃疡指数，进行比较。

3. 损伤型溃疡：大鼠麻醉后，打开腹部，暴露胃，采用乙酸注射法或乙酸涂抹法，使组织受损产生溃疡。此模型多用于研究药物对慢性溃疡的治疗评价。

4. 药物诱发型溃疡：消炎痛、阿司匹林、利血平、组胺等。

（五）抗肿瘤药物的研究方法

1. 药物体内抗肿瘤实验：腹水瘤和实体肿瘤的接种，以生命延长率和肿瘤抑制率评价药物的作用。

2. 肿瘤细胞体外培养试验法：

（1）细胞排染试验（台盼兰染色法）

（2）标记代谢物前体掺入法：标记氨基酸掺入蛋白质和标记胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷掺入核酸的测定。

3. 利用分子生物学方法，研究肿瘤发生机制和抗肿瘤药物的作用点。

（1）拓扑异构酶（TOPO）抑制剂

（2）微管蛋白活性抑制剂

（3）胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶(TS)抑制剂

（4）以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物（丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）信号转导通路）

（5）蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制剂

（6）法尼基转移酶(FTase)抑制剂

（7）肿瘤新生血管生成（TA）抑制剂

（8）端粒酶抑制剂

（六）保肝药物研究方法

1. 四氯化碳肝郁脾虚造型法：肝郁脾虚是由于肝气郁结，蔬泄功能障碍，导致脾胃消化功能紊乱，出现胁痛、厌食、腹胀、大便溏泄、四肢倦怠等脾虚症状。四氯化碳中毒有类似情况，因为四氯化碳在内质网迅速被代谢为毒性产物（游离基），使肝细胞膜发生过氧化作用而破坏。因此导致细胞内酶和电介质丢失，大量转氨酶逸入血清。并进一步影响亚细胞结构。

操作方法：

l 10％四氯化碳糠油溶液0.1ml/10g体重给予小鼠皮下注射，于实验第1天及第6天注

射，第8天处死动物观察；

l 10％四氯化碳花生油溶液0.5ml/100g体重给予大鼠皮下注射，于实验第1天及第4

天注射，形成急性中毒，第6天处死动物观察；慢性中毒以10％四氯化碳花生油溶液0.5ml/100g体重给予大鼠皮下注射，每周两次，共四周，首剂加倍。

l 观察指征：一般情况比较如活动情况、挣扎力、24小时进食量/只、体重增减、粪便

硬度和颜色等；肝组织变化如肝细胞的松变、气球样变、脂变、坏死、再生等以及炎细胞浸润、结缔组织增生、肝窦扩大等。血清学测定SGPT的变化。

2. D-氨基半乳糖法：D-氨基半乳糖肝损伤的病理变化与人类病毒性肝炎病理变化极为相似。它引起肝脏门脉区域的坏死和炎症浸润，伴有康西耳曼氏体的有丝分裂和细胞增殖，以及枯否氏细胞数增加，SGPT升高，血清总蛋白降低。以此作为指标评价药物的作用。

3. 小鼠免疫性肝损伤模型：小鼠注射丙酸杆菌或卡介苗(BCG)后，再注射微量脂多糖(LPS)，可导致严重的肝损伤。实验中可见血中GPT和GOT明显升高，血清一氧化氮也明显升高，肝脏病理检查以肉芽肿性炎症浸润为主。观察药物对这些指标的影响。

（七）降糖药物研究方法

1. 鏈脲霉素(STZ)诱致糖尿病模型：STZ结构中的亚硝基脲是细胞毒。STZ 的α-异构体有较高的毒性,可能与B细胞膜上的葡萄糖受体有较高的亲和力。STZ通过自由基损伤B 细胞，使细胞内胰岛素合成受损，造成胰岛素缺乏。

l 方法：将STZ溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液中，临用前配制。大鼠常用量为60－

80mg/kg(iv或ip)，小鼠为100－200mg/kg(iv或ip)。

l 结果：注射STZ后72小时，血糖可稳定升高，预测血糖在11.1mmol/L以上时可选

用。给小鼠连续5天注射小剂量STZ（35－40mg/kg），1－2周后引起胰岛炎。

2. 四氧嘧啶（Alloxan）诱致糖尿病模型：Alloxan是胰岛B细胞膜毒剂，通过产生超氧自由基而破坏B 细胞，使细胞内DNA损伤，并激活多聚ADP核糖体合成酶活性，从而使辅酶Ⅰ含量下降，导致mRNA功能受损，B 细胞合成前胰岛素减少，导致胰岛素缺乏。

l 方法：

动物                  剂量 (mg/kg)              途经

犬                    50－75                     iv

兔                    150－200                   iv

大白鼠                150－200                   ip

大白鼠                 40－60                    iv

小鼠                    200                      ip

小鼠                   85－100                   iv

l 结果：注射Alloxan72小时后，血糖可稳定升高，预测血糖在11.1mmol/L以上者可

选用。

三、小结

中药药理研究的方法很多，根据选择的题目和要解决的问题确定合适的方法。但最重要的是选择的方法一定要可靠、稳定和可操作性。实验前的实验设计非常重要，要三思而后行，避免悔之晚矣！这里介绍的几种实验方法仅供参考，具体操作时还要查阅有关的书籍和文献，并有必要的进行预实验，掌握第一手资料。

参考文献：

1. 李仪奎主编：中药药理实验方法学. 上海科学技术出版社，1991

2. 张均田主编：现代药理实验方法（上、下册）.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998

3. 杜冠华等主编：药理学实验指南－新药发现和药理学评价.科学出版社，2001