中国卫生检验杂志

1158中国卫生检验杂志2006年10月第16卷第10期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Oct2006;Vol16　No10

【论著】

共振瑞利散射法测定孔雀石绿

范　翔,吕昌银

1

13

,刘运美,何爱桃,贺元文,宁　玲

2111

(11南华大学公共卫生学院卫生化学检验学教研室,湖南衡阳　421001;21南华大学生命科学与技术学院,湖南衡阳　421001)[摘要]　目的:建立共振瑞利散射测定痕量孔雀石绿的新方法。方法:在硫酸介质中,孔雀石绿与磷钼酸根阴离子形成

离子缔合物而产生共振瑞利散射,据此建立了以磷钼酸根阴离子为载体,共振瑞利散射测定痕量孔雀石绿的新方法。结

果:方法的线性范围为0118～510μg/ml,检出限为55ng/ml。将其用于渔池水和水产品中痕量孔雀石绿加标测定,回收率分别为8817%～10615%和8714%～9515%。结论:方法灵敏度高,分析速度快,仪器设备简单,分析成本低,检测渔池水和水产品中孔雀石绿,结果满意。[关键词]　孔雀石绿;共振瑞利散射;磷钼酸;渔用药物

[中图分类号]　O65713　　　　[文献标识码]　A　　　　[文章编号]　1004-8685(2006)10-1158-03

Determinationoftracemalachitegreenbyresonancerayleigh-scatteringmethod

FanXiang,LüChang2yin

1

13

,LiuYun2mei,HeAi2tao,HeYuan2wen,Ning2111

(11DepartmentofHealthLaboratoryTechnology,SchoolofPublic421001,China;21SchoolofLifeScienceandTechnology,NanhuaChina)

[Abstract]　Objective:Toformmalachitegreen(MG)insamples1Methods:IntheH2SO4(PMA)toformanion-associate1Theresonancerayleighscatter2ing(RRS)thei-ociateenhancedwiththeMGincreasing1Basedonthose,RRSwasproposedforthedetermi2nationoftraceResults:TheintensityofRRSwasdirectlyproportionaltothemassconcentrationofMGintherangeof0118

～510μg/ml,andthedetectionlimitwas55ng/ml1Therecoveryrateinfishandwaterwas8714%～9515%and8817%～10615%,respectively1Conclusion:Themethodissensitive,selectiveandrapidwithsimpleinstrument1Satisfactoryresultisob2tainedforthedeterminationoftraceMGinsample1

[Keywords]　Malachitegreen(MG);Resonancerayleighscattering(RRS);Phosph-ormolybdicacid(PMA)　　孔雀石绿是一种用途广泛的碱性三苯甲烷类染料,在全世界范围内曾广泛用作水产养殖业的消毒杀菌剂、杀寄生虫[1][2]药,也可用于丝、棉、皮革等制品的染色等。研究发现,孔雀石绿对哺乳类动物具有高细胞毒性[3],但由于孔雀石绿抗菌效果好,价廉易得,我国不少养殖单位仍在使用。近年来,我国出口的鳗鲡、鲑鱼等水产品在国外常被检出孔雀石绿,使我国渔业失去了巨大的市场,给我国造成了巨大的经济损失,同时也极大地损害了我国水产品在国际贸易中的形象。因此,加大对孔雀石绿的监控力度,开展相关检验方法的研究具有非常重要的现实意义。

目前,孔雀石绿的检测方法主要是高效液相色谱法[4]、高

[5]

效液相色谱-质谱法等,也有文献应用紫外-可见分光光度法[6]对其进行检测。在共振瑞利散射研究中,孔雀石绿常作为大阳离子载体,与待测物质结合,用来检测金属离子、有机物阴离子和生物大分子[7]等,未见用其他离子作为载体,共振瑞利散射法测定孔雀石绿的报道。本文研究了痕量孔雀石绿与磷钼酸根形成离子缔合物的共振瑞利散射光谱特征、影响因素和适宜的反应条件,提出以磷钼酸根阴离子为载体,共

振瑞利散射测定痕量孔雀石绿的新方法。方法灵敏度高,分析速度快,仪器设备简单,分析成本低。检测渔池水和水产品中孔雀石绿,结果令人满意。

1　材料与方法111　仪器与试剂

日立F-4500型荧光分光光度计;上海天美UV-8500型紫外-可见分光光度计;离心机;旋转蒸发仪;分液漏斗震荡机。

50μg/ml孔雀石绿(MG,Roth公司)标准溶液:称取

010250g孔雀石绿溶于水中,准确稀释到500ml;10mg/ml磷

钼酸钠(PMA)溶液:称取磷钼酸钠5100g溶于水中,准确稀释到500ml;5mol/L硫酸。

所用试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水。

112　样品制备

11211　水产品　称取5100g捣碎样品于50ml离心管中,加

入7ml乙腈,8000r/min匀浆提取60s,超声波振荡提取

5min,4000r/min离心10min,上清液转移至梨形烧瓶中;另

取一50ml离心管加入7ml乙腈,洗涤匀浆刀头60s,洗涤液移入前一离心管中,用玻棒捣碎离心管中的沉淀,漩涡混匀器上振荡120s,超声波振荡5min,4000r/min离心10min,上清液合并至同一梨形烧瓶中。再取7ml乙腈重复一次洗涤操作。将梨形烧瓶中提取液于45℃旋转蒸干。用3ml水溶解残渣,

[作者简介]　范翔(1981-),男,硕士研究生,主要从事环境中有

毒有害物质的检测方法研究。

3通讯联系人

将烧瓶中的溶液移至10ml容量瓶中,然后每次以2ml水先后分3次洗涤烧瓶,合并洗液于同一容量瓶中,并定容到10ml。11212　渔池水　取100ml渔池澄清水样于分液漏斗中,向其中加入20ml二氯甲烷,于分液漏斗震荡机上震荡20min后,静置分层,移出二氯甲烷层于梨形烧瓶中,再向分液漏斗水样中加入20ml二氯甲烷重复一次上述操作,合并二氯甲烷于同一梨形烧瓶中。将梨形烧瓶中萃取液于45℃旋转蒸干。用3ml水溶解残渣,将烧瓶中的溶液移至10ml容量瓶中,然后每次以2ml水先后分3次洗涤烧瓶,合并洗液于同一容量瓶中,并定容到10ml。113　实验方法

取0150ml磷钼酸溶液于10ml比色管中,加入0130ml硫酸,混匀,准确加入适量孔雀石绿溶液,加水至刻度,摇匀,室温下暗处放置15min。

在紫外-可见分光光度计上,从λ=300～700nm进行扫描,获得MG-PMA体系的吸收光谱图。在荧光分光光度计上,从λ=300～550nm,以λex=λem进行同步扫描,获得MG-PMA体系的共振瑞利散射光谱图;于λ=468nm处测定体系的光散射强度I和试剂空白的光散射强度I0,计算ΔI(I-I0)值,ΔI-ρMG标准曲线法定量检测样品中MG的量。

2　结果与讨论

211　图1、图2PMA谱图。在实验条件,孔雀石绿[MG]+或磷钼酸根[P(Mo3O10)4]3-溶液的散射强度都非常弱,当[MG]+与[P

(MO3O10)4]3-形成离子缔合物[MG]3[P(MO3O10)4]后,体系

产生强烈的散射光;在300～550nm波长范围内光散射强度随ρMG的增大而急剧增大,形成的光散射峰处于离子缔合物的吸收带附近。据此推测其光散射现象是由于瑞利散射位于其分子吸收带中而产生的共振瑞利散射

。

图1　MG-PMA体系的共振瑞利散射光谱11MG(ρMAsystems:MG=316μg/ml);2～81MG-Pρμg/ml;MG=010,016,112,118,214,310,316

respectivelywithρPMA=500μg/m

l

缔合物的共振瑞利散射峰在352nm和468nm处,两个

峰均可作为定量测定波长。但由于缔合物在352nm的共振瑞利散射峰随孔雀石绿浓度的增加有一定程度的红移,因此本文选择468nm作为测定波长。212　反应条件的选择

实验表明,孔雀石绿与磷钼酸根发生离子缔合反应,适于

+

在较强的酸性介质中进行,其适宜的酸度范围为CH=0124～014mol/L。磷酸是中强酸,难以达到实验要求的酸度,加之磷酸也易与待测溶液中的一些阳离子形成沉淀,因此不适宜用于控制酸度;盐酸达到此酸度要求的浓度较高,浓盐酸易挥发,也不合适用其控制酸度;硝酸氧化性强,能将待测物氧化而不适于加入体系中。本文选用加入5mol/L硫酸013ml即可达到要求。

磷钼酸根阴离子最佳反应浓度为ρ=012～110mg/ml。磷钼酸根阴离子浓度过低或过高均导致共振瑞利散射强度降低。过低时,反应速度较慢,平衡后体系中存在的孔雀石绿阳离子浓度偏高,形成负误差;过高时体系则易形成沉淀,对ΔIRRS值测定产生干扰。

,。15℃～35℃的,,本文选择在室温下进行实IRRS在2h内较稳定。

体系形成的离子缔合物具有疏水性,放置时间过长,缔合物因疏水作用力而不断聚集,形成大颗粒物而产生沉淀。体系中不宜加入各种表面活性剂增稳:阳离子表面活性剂与磷钼酸根同样能发生缔合反应而产生共振散射,浓度较大时还能产生浑浊;阴离子表面活性剂则可与孔雀石绿发生缔合反应而对体系产生负干扰;非离子表面活性剂形成的胶束水化膜,在酸性条件下易被磷钼酸根破坏,发生自凝集而形成团块,同样不适宜加入体系中。

反应物的离子缔合常数较大,体系中加入少量的有机溶剂甲醇、乙醇对体系的ΔIRRS影响很小。213　共振瑞利散射强度与孔雀石绿浓度的定量关系

在最佳实验条件下,取适量的孔雀石绿,按实验方法操作,分别于测定波长468nm处测定I和I0,以ΔI对相应的孔雀石绿浓度绘制标准曲线,在0118～510μg/ml范围内,ΔI值与孔雀石绿浓度成正比,其一元线性回归方程为Y=107312X+213101,相关系数r=019998。多次测定空白溶液共振瑞利散射光强度IRRS(m=6,n=11),Sb=19168,方法检出限为55ng/ml,定量测定下限为0118μg/ml。按照实验方法,在线性范围内选择低、中、高3组浓度进行精密度实验,RSD分别为4172%、1162%、1175%(n=11)。214　方法的选择性

用磷钼酸根体系于468nm处测定1μg/ml孔雀石绿溶液,考察共存物质的干扰。当相对误差≤5%时,共存物质的

+

允许量(浓度比)为:尿素、甘氨酸、葡萄糖、NH4等为1000倍;

2+-甲醇、乙醇、乙腈、I-、Cu等为500倍;二氯甲烷、SCN、

-3+2+2+2+

H2PO4、Al、Mg等为200倍;柠檬酸、草酸、Ca、Co、

Cd等为100倍;Fe、Pb等为20倍;十二烷基磺酸钠为5

2+3+2+

图2　MG-PMA体系的吸收光谱

ρMG=316μg/ml;ρPMA=500μg/ml

倍;十六烷基二甲基溴化铵、十二烷基苯磺酸钠等为015倍。

(下转第1169页)

3　讨论

2002年起本地区出现了3种以前从未检出过的福氏志贺菌血清型,依次是4c、2(未定型)和1c,分别占总检出株数的15115%、2118%、0136%。本地区志贺菌新菌型的出现可能存

在以下两种情况:(1)区域外流行的志贺菌血清型随外来人员流动进入本地区。经查阅大量资料后发现,福氏志贺菌4c在前苏联曾报道过[3],本地区首株是从一名来自新疆的少数民族同胞中分离到的,新疆地域与前苏联相接,患者有接触到福氏志贺菌4c的可能,而后再将此菌型带入本地区。从文献检索中我们仅看到在2000年8月浙江省仙居县有1例福氏志贺菌2c检出(本文定为福氏2未定型)[4],早于当地的首株F2c志贺菌的发现时间(2003年7月),浙江和上海相邻,这也为鉴定该菌提供了一定依据。所以福氏志贺菌4c和福氏2未定型属于外地域带入的可能性较大。(2)当地流行的志贺菌血清型发生抗原性变异。引起志贺菌发生变异的有物理因素、化学因素、生物性因素。曾有报道,福氏志贺菌2a型在噬菌体的作用下发生溶原性转换,由2a型向2b型转变,也可以向其他的血清型转变[3,5]。有学者认为除福氏6型外,福氏志贺菌的各血清型和亚型、变体都是相应的温和噬菌体对福氏y变型体溶原化,而使3,4抗原基础糖链结构变化的结果[3]。这些资料均有效证明了志贺菌抗原性变异的存在。福氏志贺菌1c的资料,现过,4c,。志贺菌新的血清型的出现后,,收集其生物学及药敏资料,为积极治疗病人提供有力依据。

本文报道的福氏志贺菌2未定型是群3,4血清和群7,8血清均能凝集的特殊血清型,在抗原表上不能做出合理的解释。这一血清型的出现,一定有其特殊的原因。有待做出进一步的研究。值得注意的是福氏志贺菌4c的出现,和2b成为优势菌型,以及2型未定型的出现都是在2002年,其中一定有一个共同的原因。

本地区志贺菌的优势菌型出现了明显的变迁。2003年之

(上接第1159页)3　应用

前福氏志贺菌2a在本地区一直处于优势地位,但呈明显地逐

年下降趋势。2003年,福氏志贺菌2b、1a、2a、4c在构成比上十分接近,分别为19163%、18169%、17176%、16181%,其中2b以微弱优势取代2a占居首位成为优势菌型。而2002年新出现的福氏志贺菌4c每年的构成比呈逐年上升趋势,2004年和2005年已占绝对优势,成为引起本地区细菌性痢疾的优势菌型。从表2、图1可以看出,福氏2a呈下降趋势,而福氏4c明显呈逐年上升,其他菌型基本上在一定范围内波动,因此从长时期来分析,福氏2b在2003年占微弱优势可能只是一种过渡,新菌株4c取代2a成为优势菌型才是真正值得我们重视的。福氏志贺菌4c成为引起某一地区细菌性痢疾的优势菌型在国内尚无相关报道,因此我们要高度重视这一优势菌型变迁现象,加强对菌痢的长期监测,积极控制菌痢传播的各个环节,避免发生新优势菌型造成痢疾流行。

世界各地流行的志贺菌每隔20～30年发生一次明显的变迁,至于引起变迁的原因,至今仍不十分清楚[6]。本地区的变迁可能是由于新菌型的出现,但在新菌型出现前,原来的优势菌型福氏2a已经呈现下降趋势,[]

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ˇ

ˇ

通过样品萃取,按照实验方法进行加标回收实验,标准物

质的加入量分为低、中、高3组,进行7次平行测定计算样品加标回收率。加标量分别为016、118、316mg,渔池水样加标回收率分别为10615%、9813%、8817%;水产品的加标回收率分别为9515%、9412%、8714%,结果可靠。

取1100ml加标样液,加入到酸性磷钼酸根体系中,用水稀释至刻度,摇匀。放置适当长时间后,按实验方法进行共振瑞利散射测定。用共振瑞利散射法和国标法进行对照检测处理后样品中的孔雀石绿,结果吻合。

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