基因工程原理习题

1、假如从一个原核生物中cloning某基因（1-2kb），

请谈谈它的基本步骤？

①限制性内切酶切割外源DNA和载体 ②将外

源DNA片段与载体连接 ③转化 ④筛选

2、什么叫基因工程（GeneEngineering），试从理

论和技术两个方面谈谈GeneEngineering诞生的基

础？

基因工程：在体外将核酸分子插入病毒、质粒

或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之

参入到原来没有这类分子的宿主细胞内，而能持续

稳定地繁殖。

理论基础：近几十年来，由于受到分子生物学、

分子遗传学发展的影响，基因分子生物学的研究取

得了前所未有的进步。而这些学科的综合成就，又

为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础：

①在40年代确定了遗传信息的携带者，即基

因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗

传的物质基础问题；

②在50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模

型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传

递的问题；

③在50年代末期和60年代，相继提出了"中

心法则"和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，

从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。

技术基础：

①60年代-70年代，限制性核酸内切酶和DNA连

接酶解决了对DNA分子进行体外的切割和连接；

②基因克隆载体的出现

③大肠杆菌转化体系的建立

④60年代发展的琼脂糖凝胶电泳和Southern转

移杂交技术对DNA片段的分离和检测十分有用。

3、基因克隆、基因操作、基因重组、基因工程的概

念及其相互联系。

基因克隆（Genecloning）：是指对基因进行分

离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的

基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌

遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。

基因工程：是通过基因操作，将目的基因或DNA

片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复

制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表

达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。

基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检

测、表达、重组和转移等操作的总称。

基因重组：不同来源DNA分子通过共价连接（磷

酸二酯键）而组合成新的DNA分子的过程。

它们的相互关系：基因工程是通过基因重组实

现的，但基因重组并不都是严格意义上的基因工程，

基因重组是基因操作范畴的概念，包括实验研究和

生物技术的基因重组事件，而基因工程则专指为实

践应用而进行的重组事件。基因操作是基因工程的

技术基础；基因克隆很多时候并不涉及遗传的改良。

4、为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然

产物？

生物学和遗传学发展到现在无非就是向两个方

向发展，宏观和微观的，宏观发展无非就性状研究，

外观特征等，而微观方面就是像小分子方向基因，

蛋白等方面发展，而研究和链接这两方面的桥梁就

基因工程技术。

第二章分子克隆工具酶

1、限制性内切酶可划分为哪几个类型，各自有何特

点？

根据酶的结构、作用的不同，可将限制性

内切酶分为三种类型。Ⅱ型限制性内切酶具有

高度特异性的DNA裂解点,而Ⅰ型和Ⅲ型兼有

修饰（甲基化）作用和依赖于ATP的活性，但

不能在识别序列上直接裂解DNA，故用途较少。

因此，Ⅱ型限制性内切酶是基因工程和基因诊

断中重要的工具酶，通常不特别说明的即为Ⅱ

型限制性内切酶。

2、哪些酶可用于DNA片段的末端标记？

KlenowDNA聚合酶和T4或T7DNA聚合酶在对

DNA片段进行末端补平反应或末端的置换反应时可

引入标记的核苷酸。

3、DNA聚合酶有哪些类型，各有什么活性？

①E.coliDNApolI：5’-3’DNA聚合酶活性；5’

-3’DNA外切酶活性；3’-5’DNA外切酶活性。

心相印图文工作室整理luqiu910

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②E.coliDNApolI大片段（Klenow酶）：5′→3′

DNA聚合酶活性；3′→5′DNA外切酶活性；5’-3’

DNA外切酶活性。

③T4噬菌体DNApol：5′→3′DNA聚合酶活性（与

Ｋlenow酶相似）；3′→5′外切酶活性（Ｋlenow

酶×200）：在无dNTP时只有该活性。（常用于填平

dsDNA的3′缩进末端及水解dsDNA的3′突出末

端。）

④T7噬菌体DNApol及测序酶：5′→3′DNA聚合

酶活性; 3′→5′外切酶活性（Ｋlenow酶×

1000）。

⑤耐热DNA聚合酶（Taq酶）：在高温下仍具活性

的DNA聚合酶。5′→3′DNA聚合酶活性；5’-3’

DNA外切酶活性。

⑥反转录酶（依赖于RNA的DNApol）：5’→3’DNA

聚合酶活性(需Mg

2+

）；RNaseH活性（5’→3’及3’

→5’RNA外切核酸酶活性)；

⑦末端转移酶（terminaltransferase）（DNA修饰

酶）：不依赖于模板的DNA聚合酶，在二价阳离子存

在下，催化dNTP加在DNA分子的3′-OH端。

4、在分子克隆中所用的酶主要作用于哪些底物？

限制性内切酶（又称内切限制酶或限制酶）作

用底物：识别和切割双链DNA分子中某种特定核苷

酸序列。

连接酶作用底物：将双螺旋DNA分子的某一条

链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出

现的单链缺口封闭起来。

修饰酶作用底物：能催化稀有碱基参入RNA或

DNA，或对原有碱基进行修饰，以防止限制性内切酶

的破坏。

第三章分子克隆

1、何为载体?一个理想的载体应具备那些特点？

将外源DNA或基因携带入宿主细胞（host

cell）的工具称为载体

载体具备的特点：

①在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）

②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，

同时不影响其复制

③有一定的选择标记，用于筛选

④最好具有较高的拷贝数，便于制备

2、作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元

件？

克隆载体：复制起点ori、酶切位点、筛选标志；

表达载体：启动子、酶切位点、转录终止序列、筛

选标志，原核表达载体还要有SD序列。

3、抗性基因（Resistantgene）是目前使用的最广

泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举

两例说明其原理？

氨苄青霉素抗性基因ampr 、四环素抗性基因

tetr、氯霉素抗性基因Cmr、卡那霉素和新霉素

抗性基因kanr

①氨苄青霉素抗性基因ampr:

青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结

合并抑制其活性，抑制转肽反应.氨苄青霉素抗性

基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，

抑制转肽反应并催化b-内酰胺环水解（水解青霉

素），从而解除了氨苄青霉素的毒性。

②四环素抗性基因tetr：

四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从

而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由

399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进

入细胞。

4、为什么野生的λ噬菌体DNA不能直接用于基因工

程的载体？应该怎样对其进行改造来构建λ噬菌体

克隆载体？

不适宜的原因：

①噬菌体DNA没有容载能力，因为噬菌体的头部对

DNA包装的量是有限制的，不能大于基因组的105%，

所以要将λ噬菌体改造成载体，必须削减分子量。

②野生型的λDNA对于一些常用的酶都有多个识别

和切割位点，不便于克隆。

③没有可供选择的标记。

④野生型的λ噬菌体具有感染性，因此不够安全。

改造：①去掉基因组中一部分对裂解生长非必须的

DNA片段

②消去一些多余的限制性内切酶识别与切割位点，

也可以引入多克隆位点MCS

③添加合适的遗传标记便于筛选

5、YAC载体具有什么样的功能性DNA序列？为什么在

克隆大片段时，YAC具有优越性？

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YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝

粒，一个DNA复制起点，两个端粒。

YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏

粒办不到的。大片段的插入可能包含完整的基因，

在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能

够减少完整基因组文库所需的克隆数目。

6、何为α-互补，在载体构建中有何作用？

答：α-互补：指lacZ基因上缺失近操纵基因区

段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半

乳糖苷酶（β-galactosidase，由1024个氨基酸

组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于

在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶阴性的突变体之

间可实现的功能互补而建立的。

将缺失编码第11-41位氨基酸的β-半乳糖苷酶基

因称为lacZ△M15基因而将半乳糖苷酶基因(lacZ)

的调控序列和编码β-半乳糖苷酶N端140个氨基酸

的序列称为lacZ’.这两个基因的产物单独存在时

都无酶学活性,但混合在一起时却有酶学活性.所以

在载体上加lacZ’/(MSC),并在受体菌中引入lacZ

△M15即可实现α-互补.IPTG是lac操纵子的诱导

物,底物X-gal被β-半乳糖苷酶分解后可以产生蓝

色.如果质粒载体中插入了外源DNA, lacZ’的产

物则不能与lacZ△M15基因的产物实现α-互补，在

IPTG诱导下不能产生有活性的β-半乳糖苷酶，菌

落便不可能呈现蓝色。白色菌落便是含有插入了外

源DNA的重组质粒。因此可利用菌落颜色变化来筛

选插入外源DNA的重组质粒。

这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主

要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β

-半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的λ

载体转入lacˉ的宿主菌后，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）平板上形成白色的噬

菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。

第四章大分子分离和分析

1、分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳

的异同点？

同：①原理相同。琼脂糖、聚丙烯酰胺均

为无反应活性的稳定支持介质，可降低对流运动，

故使电场中的分子电泳迁移率仅与分子的摩擦系数

成反比。在一定电场强度下，DNA分子的迁移率取

决于核酸分子的大小和构象。

②凝胶浓度的高低影响凝胶介

质孔隙大小；浓度越高，空隙越小，其分辨能力也

就越强；反之，浓度降低，空隙就增大，其分辨能

力也就随之减弱。

异：琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为

02.Kb-50Kb之间；而聚丙烯酰胺分辨DNA片段的范

围为1-1000bp，分离小片段效果最好，分辨率极高，

相差1bp的DNA也可分开。

2、琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移

速率的因素？

DNA构象、分子量大小、碱基组成与温度、

琼脂糖浓度、嵌入染料EB存在与浓度、电压、电场

方向、电泳缓冲液

3、小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切

割不动，试分析可能原因及克服方法？

最可能的原因：从细菌沉淀或从核酸沉淀中

吸上清时注意不够，带了杂蛋白。其最根本的原因

是因为细菌的细胞壁成分或核内某些蛋白质可能抑

制限制酶活性。

克服方法：用酚氯仿对溶液抽提；用离心柱

层析法纯化DNA。

4、什么是Western blot？它和Southern blot

有何区别？

Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从

凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体 进行检测。

它与Southern的不同在于探针的性质不

同，在Western印迹中使用的探针是抗体（蛋白质）。

5、印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下 需要使用这些方法。

答：Southern杂交是以DNA或RNA为探针，检测DNA 链，用于外源基因整合的鉴定及分析。Northern杂

交是以DNA或RNA为探针，检测RNA链，用于外源 基因转录产物特异mRNA的检测。Western杂交是利 用抗原与抗体的特异结合的原理检测外源基因表达 产物特异蛋白质的生成。

6、核酸分子标记有哪些方法，各有何特点？

（一）均匀标记:需要复制一段新的探针分子,在复 制过程中掺入标记的核苷酸,从而使整个新分子被 心相印图文工作室整理luqiu910

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均匀地标记.显著特点是探针分子的标记不局限在 一个位点上,因此,均匀标记可使探针的标记信号扩 大,得到高比活度的探针.

（1）切口平移标记,新合成的被标记的分子可以代 表该待标记DNA分子的绝大部分核苷酸序列.

（2）随机引物标记,扩增出来的DNA产物包括从任 意某个位点起始的单链DNA片段,产物群体包含了 目的DNA所有核苷酸序列信息,多用来标记DNA片 段.

（3）PCR扩增标记,尤其适合于探针DNA浓度很低 的情形.（4）单链探针,不存在互补双链,因此可以 消除探针的两条链在杂交过程中形成无效双链的可 能性,从而增加探针与靶序列探针与靶序列之间形 成杂合体的稳定性,提高检测的灵敏度.

（二）末端标记:直接将探针分子的某个原子替换为 放射性同位素原子,或直接在探针分子上加入标记 的原子或复合物。

（1）DNA片段的末端标记,末端标记主要通过酶促 反应来完成,KlenowDNA聚合酶和T4或T7DNA聚 合酶在对DNA片段进行末端补平反应或平末端的置 换反应时可引入标记的核苷酸.。

（2）寡核苷酸的标记,合成的寡核苷酸主要通过T4 多核苷酸激酶在5′末端引入标记的磷酸基团进行 标记,也可利用末端转移酶在3′末端连接标记的核 苷酸.

7、DNA转化有哪些方法，各有何优点？ 钙处理，钙可以获得感受态的细胞,这是实验

室最常用的方法,它可以用于大多数的DNA转化。 其他化学处理，这种方法比钙处理的方法要更

复杂,但它获得高感受态的细胞。这可以用于构建基 因库或是当你有少量非常珍贵的DNA。

电穿孔、级差非常高,但是要限制DNA中盐的 浓度。