微生物多样性的调查与观察

微生物多样性的调查与观察

程雅楠

摘要：分组对校园起霞坡附近水体、土壤、空气的采样，稀释并涂布于牛肉膏蛋白胨、高氏一号和马铃薯培养基平板上进行培养，并利用培养物，通过革兰氏染色观察微生物芽孢和荚膜的形态。对插片培养出的菌落进行观察，对其微生物细胞大小进行微测及显微直接技术。采集阴沟中的环境污水，从中分离噬菌体，并对其进行分离、扩增与检验。从而达到掌握微生物实验基本操作方法、熟知典型微生物形态特征，学会接种培养分离某些微生物的目的。

关键词：微生物；形态观察；

1. 实验材料与方法

1.1 样本采集及处理

2011年9月于南京师范大学起霞坡，对土壤采用采样器进行五点取样，垂直取15 cm 深度的土壤，每点取样量一致，将土样均匀混合并装入灭菌的信封中封好，将土样带回实验室进行处理，混匀，称取1克土壤放入含9ml无菌水的三角瓶中（内含玻璃珠数粒），振荡分散。用水样采样器分别取污水和水库水约500ml。准备牛肉膏蛋白胨平板和马铃薯培养基，打开皿盖在空气中暴露5min后盖上皿盖（室外和室内各一个）。上述准备工作完毕后，将2克土壤放入含20ml无菌水的三角瓶中(内含玻璃珠数粒），混匀后用加样枪和Tips在Epp管中进行10的倍比稀释成10-2的梯度样品。将采集的水库水, 分别稀释10-1,10-2。采集校园J6旁荷花池中的水样于塑料瓶中，以备分离噬菌体使用。

1.2 实验仪器及用具

加样枪、离心管、酒精灯、显微镜/载玻片、接种环、解剖针、解剖刀、镜台测微尺、目镜测微尺、血球计数板、细菌过滤器，普通离心机；

革兰氏染色液一套、黑色素、碱性品红染液;插片培养的放线菌平板与霉菌平板；曲霉，青霉，根霉示范片；酿酒酵母菌悬液；液体牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体上层培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂固体底层培养基;

1.3 样品的平板涂布、平板划线转接与培养

微量加样枪分别取0.1ml含菌液体放于固体培养基平板表面中央，用无菌的玻璃涂棒将样品液滴均匀涂布分散在平板表面。土壤稀释度10-2样液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，高氏一号培养基，马铃薯培养基。库水稀释度为10-1，10-2样液涂布于2个牛肉膏蛋白胨培养基。将以上平板倒置放入培养箱内进行培养。

插片法培养：在一个新鲜高氏一号平板的底部用记号笔将平板一分为二，选取已培养好的高氏一号培养基上放线菌得到良好分离的平板，用无菌接种环挑取2个不同形态放线菌菌落分别划线接种于新鲜的高氏平板的两个区域，然后用无菌眼科镊以每个区域5-6片的数量将无菌盖玻片分别以45度角插入培养基上的划线轨迹3-4mm，放入28℃正置培养，作为下一个实验的材料。做霉菌划线转接，平板选择马铃薯培养基，方法与之相同。

1.4 利用革兰氏（Gram）染色细菌及细菌的荚膜染色

对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及待测菌进行革兰氏染色。

革兰氏染色：涂片→ 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色→媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。→脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗→复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。

荚膜染色：无菌操作挑取一环硅酸盐细菌的液体培养物在载玻片上涂抹均匀，并使其自然干燥→用碱性复红进行初染3~5分钟，洗去多余染液→在载玻片的另一个区域滴加一滴印度墨汁，用另一块干净的载玻片的短边将墨汁推向细菌样品液滴直至推到第一块载玻片的末端为止，以形成一个均匀的墨汁与样品混合的推片→在空气中自然干燥或者用吹风机的冷风将其吹干。

1.5 观察微生物菌落特征及利用显微镜观察微生物形态等特征

1.5.1 人体口腔微生物的观察

（1）.取样：用无菌牙签在牙缝内反复擦拭几遍，然后将牙签涂布于载玻片上(事先放一小滴水)。

（2）.制片(单染色法):取样 →固定 →沙黄染色2分钟 →水洗至无色流液 →吸去残留水 →酒精灯干燥

(3).显微镜油镜观察：按照低倍-高倍-油镜的顺序进行观察。

1.5.2 细菌荚膜、细菌鞭毛、细菌芽孢的观察

使用显微镜

1.5.3 观察放线菌气生菌丝和基内菌丝

使用眼科镊将之前培养好的高氏一号平板中的盖玻片夹起放置于一块干净的载玻片上，然后用显微镜的高倍镜对插片培养基界面以下的营养菌丝以及培养基界面以上的孢子丝的形态进行观察。如果孢子丝具有螺旋，注意孢子丝的螺旋方向以及其它形态指标，这是放线菌的分类鉴定依据之一。

1.5.4 霉菌形态的显微观察

使用眼科镊将培养好的马铃薯平板中的盖玻片夹起放置于一块干净的载玻片上，然后用显微镜的高倍

镜对插片培养基界面上下的霉菌菌丝结构以及子实体形态进行观察。注意不同霉菌的菌丝分化结构以及子实体的差别。

1.5.5 观察黑根霉菌丝情况和子囊孢子情况

使用显微镜着重观察及辨认孢子囊、包囊梗、假根

1.5.6 观察黑曲霉菌丝分隔情况和分生孢子着生情况

使用显微镜着重观察及辨认分生孢子梗、足细胞和分生孢子

1.5.7 观察青霉菌丝和分生孢子着生情况

使用显微镜着重观察及

1.6 对细菌的显微直接计数及测定细胞大小

1.6.1测定酵母菌细胞的大小

测定的工具：目镜测微尺 镜台测微尺

目镜测微尺的校正：在40×镜下，看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微的刻度平行，移动载物台，使目镜测微尺的0点与镜台测微尺的某一刻度重合，然后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。计算两刻度间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。由于镜台测微尺的刻度每格长10µm，所以可得

目尺每格长度(µm)=（台尺格数×10）/目尺格数

菌体大小的测定：制作一片酵母菌的盖片，取下镜台测微尺，将盖片置于载物台上，然后在40×镜下用目镜测微尺测量菌体的长和宽。

1.6.2 酵母菌显微直接计数

原理：活菌计数法——平板菌落计数法

方法：1.取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖血盖片。

2.取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。

3.用10×镜观察并将计数室移至视野中央。

4.在10×镜下计数：计数4个（或5个）中格的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上16

（或25）就得出计数区总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。

1.7 噬菌体的分离与纯化

1.7.1 噬菌体的分离、扩增与验证

1. 样品采集：从环境中的污水取样50ml水样带回到实验室

2. 敏感细菌培养：经活化的大肠杆菌固体斜面一支，接种一环至20ml牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，摇瓶

培养至对数期（18小时左右）；（老师预备）

3. 环境样品的噬菌体扩增：用无菌移液管取上述敏感细菌培养液1ml于盛有10ml 2×牛肉膏蛋白胨液体培

养液的三角瓶内，同时加入9ml环境污水样品，37℃继续摇瓶培养16小时以增殖噬菌体；

1.7.2 二 噬菌体的分离与验证

1 裂解液制备：上述增殖混合液取1ml放入2个灭菌的Epp离心管内，经离心机5000r/min for 5分钟，上

清用带有0.45u微孔滤膜滤器的注射器进行过滤除菌，得到裂解液1mL；

2 平板培养：1）在一个牛肉膏蛋白胨平板上滴加0.2ml的裂解液，用玻璃涂棒均匀涂布，37℃培养，以检

测滤液是否无菌；

1.7.3 将裂解液在离心管中稀释10-10000倍，然后每稀释度各加0.1mL大肠杆菌菌液。混匀后，在37℃

保温5min待噬菌体吸附并侵入寄主细胞。

1.7.4 将上述噬菌体和敏感菌的混合液加入9mL 50℃左右的牛肉膏蛋白胨半固体培养基试管中，立即揉搓

试管使培养基与菌液充分混匀，并对号倒在含有底层琼脂平板的表面，迅速铺平凝固。倒置于37℃培养箱中培养18-24h，即可观察到噬菌斑。

2 实验结果

2.1 水体及土壤环境中微生物的数量统计

通过严格无菌操作，采用牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、-2马铃薯培养基培养稀释度为10的土壤样液，采用牛肉膏蛋白胨培养-2-3基培养稀释度为10，10的水库水样液。 样品中活菌数(个/ml) = 平板菌落数×20×稀释倍数

并且选择平板菌落数量适中切分布均匀的稀释平板进行活菌数计算。

土壤环境微生物计数

观察得大肠杆菌染色呈红色，金黄色葡萄球菌染色呈蓝紫色，待测菌染色呈蓝紫色。

显微镜下，芽孢呈圆形或椭圆形，由于芽孢壁厚，透性低，不易着色，可观察到菌体染色，二芽孢不着色或仅显很淡的颜色。荚膜疏松较薄，不易染色，可观察到菌体着色而将不着色的球状透明荚膜衬托出来。

2.3 细菌、放线菌和真菌的平板菌落的形态特征

细菌菌落呈凝胶状、表面较光滑、湿润、正反颜色一致。

放线菌菌落致密、坚硬、多皱、不透明、干燥。

真菌菌落比细菌大，不透明，表面光滑、湿润、粘稠，多呈乳白色。还观察到霉菌的菌落，霉菌菌落比细菌菌落大，菌丝组成了疏松的绒毛状、絮状或蜘蛛网状，无固定大小，延至整个培养基中，产色素，有白色、灰色、绿色等，使菌落显色。

2.4 放线菌菌丝以及孢子丝的形态特征

可观察到基内菌丝伸入营养基质内；气盛菌丝位于营养基质上方。且气生菌丝分化形成孢子丝，孢子丝有的呈直线形，有的呈波曲形，还有的呈螺旋状。

2.5 霉菌的菌丝结构，孢子形状，形态

霉菌的菌丝结构分为基内菌丝、气生菌丝、繁殖菌丝。

霉菌的孢子形状：观察可发现在菌丝分支顶端有形成单个或成簇多样形的孢子。还有的在菌丝横膈膜断裂处，产生许多孢子，多呈短柱状、筒状。

2.6显微测微的实验结果

目镜测微尺每格长度= 两个重叠刻度见武警测微尺个数*10/两个重叠刻度间目镜测微尺格数 经目镜测微尺的校正，得：目镜测微尺每格长度= 10*10/38 = 2.63

取下物镜测微尺，换上酵母菌水浸制片。观察显微镜视野范围内，菌体的长度和宽度和占目镜测微尺几格。

经测量，得到数据：3.0×2.9,2.1×2.5,2.4×2.6,3.5×3.3，2.7×3.0

平均得酵母菌大小为：2.74×2.86

3 讨论

校园起霞坡附近水样和土壤的采样与培养，发现此地区水样中主要存在的微生物为细菌，土壤中存在的微生物有放线菌、霉菌，而放线菌存在的数量较少，说明该片土壤环境不适合放线菌生存，并初步了解了真菌、细菌等微生物的菌落形态。

革兰氏染色细菌过程中，部分大肠杆菌被染成蓝紫色，这与应有的结果不符合，主要是因为染色过度。所以，革兰氏染色操作的关键在于严格掌握酒精脱色程度。因为如果脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够阴性菌可被误染为阳性菌，导致观察到相反的实验现象。革兰染色不仅可以观察细菌的形态，同时将细菌分为两大类。一类是染色阳性菌是紫色，另一类染色阴性的是红色。

酵母菌显微直接计数的优缺点： 优点：不用稀释梯度也不需要很长时间的培养可以直接进行检测；缺点：不能分辨出死细胞和活细胞，而且受视野范围的控制比较难以精确计数。

在分离纯化噬菌体的实验中，实验结果噬菌斑观察得并不明显，主要可能是在操作过程中引进了杂菌，可能在稀释菌体、转接至培养基、加大肠杆菌增殖的裂解液未被过滤彻底等过程中引入杂菌，使培养环境被污染，导致实验失败。

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