副溶血性弧菌质粒携带及生物学特性研究

102中国卫生检验杂志2006年1月第16卷第1期　Ch i nese Journa l ofH ealt h Laborat ory Technology , Jan 2006; V ol 16　No 1

【经验交流】

副溶血性弧菌质粒携带及生物学特性研究

程苏云, 梅玲玲, 任锦玉, 陈　黎

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(1. 浙江省疾病预防控制中心, 杭州　310009; 2. 温州医学院卫生检验系, 浙江温州　325000)

[关键词]　副溶血性弧菌; 血清型; 质粒; 耐药

[中图分类号]　R378. 3　　　　[文献标识码]　C 　　　　[文章编号]　1004-8685(2006) 01-0102-02　　副溶血性弧菌(Vi brio par ahe m ol y ticus , 以下简称为副溶菌) 在浙江省的细菌性食物中毒中一直为主要的病原菌, 占历年细菌性食物中毒的60%～70%。且近几年来, 副溶血性弧菌食物中毒的发生率呈上升趋势。针对这一现象, 我们对1986年以来收集的67株副溶血性弧菌食物中毒菌株进行血清、耐药、质粒等检测, 以掌握我省副溶血性弧菌携带质粒等生物学特性。从而为副溶血性弧菌食物中毒进行有效地控制和快速诊断提供依据。1　材料与方法

1. 1　菌株来源

实验菌株主要为1986、1999、2000、2001及2002年菌株主要来源于临床病人排泄物(粪便、呕吐物等)、可疑食物、容器用具等涂拭物及食品监测等标本分离菌株。

1. 2　试剂

副溶血性弧菌诊断血清来源:日本“SE I KEN ”血清。副溶血性弧菌质粒提取试剂:由上海生工生物工程技术有限公司提供

1. 3　方法

1. 3. 1　血清血型鉴定方法　按卫生防疫细菌手册[1]及细菌检验分析手册[2]中有关方法进行。

1. 3. 2　质粒提取方法参照文献[3]方法进行　取2m l 细菌培养物, 离心去上清。用100μl EDTA 溶液悬浮, 置冰浴30m in 后, 缓慢加入溶液Ⅱ(0. 2m o l /LN aOH 、1%SDS ) 200μl , 置冰浴20m in 。迅速加入150μl 溶液Ⅲ(5m o l /L乙酸钾60m l 、冰乙酸11. 5m l 、水28. 5m l ) 放置40m in 后, 离心弃上清, 加入2倍量的冷异丙醇混合, 离心。用1m l 70%乙醇于4℃洗涤沉淀两次, 在空气中干燥10m i n 。加入20μl TE 缓冲液。使用稳压稳流电泳仪, 水平电泳槽。琼脂糖浓度为0. 7%,电压为120V 。

1. 3. 3　副溶血性弧菌耐药检测　取24h 培养菌培养物, 按V I TEK 细菌鉴定仪操作说明, 进行耐药鉴定。2　结果

2. 1　副溶血性弧菌血清型分布情况

对1986年以来收集的67株副溶血性弧菌进行血清型鉴定结果如表1所示。1986～1998年副溶血性弧菌菌株的主要血型群为O1和O 4, 二者之和占总检测菌株的80. 76%;1999

图1　部分副溶血性弧菌质粒电泳图谱

[作者简介]　程苏云(1957-) , 女, 副主任技师, 主要从事微生物

检验研究。

1. DNA /H i n d IIIM arker , 2(#S M 0101) ; 2. 99-3; 3. 01-13; 4. 99-1; 5. 99-11; 6. 02-11; 7. 00-12; 8. 99-8; 9. 02-9; 10. 99-4; 14. -50年代1986～[***********]02合计

年以后收集的菌株以O 3为主要血清群, 占检测菌株的

51. 22%,其中O3K 6血清型菌株占O 3血清型76. 19%。

表1　67株副溶菌血清群分布情况菌株数2612913767

O1O2O3O4O5O6O7其他O3∶K69401115

000101

4575425

12001013

000123

010001

000101

121307

0453316

2. 2　副溶血性弧菌质粒检测结果

对不同年代收集的40株副溶血性弧菌进行质粒检测结果(表2、图1) 发现, 40株副溶血性弧菌, 有31株携带

9416bp 质粒, 检出率高达77. 5%;其中有7株副溶血性弧菌除携带9416bp 质粒外, 还包含了26282bp 、6557bp 等质粒, 最多的3株菌, 同时携带了9416、26282、6557、23583bp 4种质粒。各年代的菌株其质粒携带率不禁相同, 以1999年分离的菌株质粒携带率最高且多为多重携带。

表2　40株副溶菌经质粒提取结果

年代菌株数9416bp 26282bp 6557bp 23583bp 23130bp 2322bp 1882bp 无质粒[***********]02合计

58612940

3759731

030003

020013

020002

000213

000011

010012

211329

　　表2中除9416bp 质粒外, 其它质粒均在检出9416bp 质粒的同时检出。

中国卫生检验杂志2006年1月第16卷第1期　C hinese Jou rnal ofH ea lt h Laborator y Technol ogy , Jan 2006; Vol 16　No 1103

2. 3　副溶血性弧菌药敏检测结果

对32株副溶血性弧菌进行药敏试验结果表明(表3), 副溶血性弧菌对氨苄西林及头孢唑啉显示较高的耐药性, 耐药菌株分别占检测菌株的59. 37%和46. 87%;敏感的菌株只占25. 00%和18. 75%。

表3　32株副溶菌药敏试验结果

抗生素名称氨苄西林氨曲南头孢唑啉头孢吡亏头孢替坦头孢他啶头孢曲松环丙沙星庆大霉素亚胺培南左旋氧氟沙星呱啦西林妥布霉素复方新诺明

耐药株数19(59. 37) 1(3. 10) 15(46. 87) 0(00. 0) 0(00. 0) 1(3. 10) 0(00. 0) 0(00. 0) 0(00. 0) 0(00. 0) 0(00. 0) 0(00. 0) 0(00. 0) 0(00. 0)

中介株数5(15. 63) 0(00. 0) 11(34. 37) 1(3. 10) 0(00. 0) 0(00. 0) 0(00. 0) 0(00. 0) 1(3. 10) 0(00. 0) 0(00. 0) 0(00. 0) 1(3. 10) 0(00. 0)

敏感株数8(25. 00) 31(96. 87) 6(18. 75) 31(96. 87) 32(100. 0) 31(96. 87) 32(96. 87) 32(100. 0) 31(100. 0) 32(100. 0) 32(100. 0) 32(100. 0) 31(96. 87) 32(100. 0)

血清型引起的大规模的食物中毒。

副溶血性弧菌耐药检测结果表明, 不同年代的副溶血性弧菌其耐药特性基本相同, 对氨苄西林和头孢唑啉等抗生素均显示一定耐药特性, 但有增高的趋势。从被检的菌株看, 1986年的菌株其对氨苄西林的敏感菌株占60%,而1999～2002年的菌株仅占20%～37%头孢唑啉的敏感率也从40%降之25%以下。在检测中还发现2001年收集的1株菌株对头孢他啶显示耐药, 提示副溶血性弧菌的耐药性变化可能性。通过耐药检测, 副溶菌对氨基糖苷族如庆大霉素及妥布霉素、酮诺喹族如环丙沙星以及氯霉素等抗生素敏感, 仍可以作为副溶血性弧菌食物中毒治疗首选药物。

细菌质粒虽不是细菌繁殖所必需, 但越来越多的资料表明质粒在细菌耐药性的形成、毒力、侵袭力以及理化因素抗性的增强方面起着重要作用。同时多数学者还认为由于质粒在多数革兰阴性菌之间相互传递, 使某些机会致病菌转变为耐药菌株, 是医源性感染的重要原因。从表1显示分子量为9416bp 是本次检测的副溶菌株所携带的主要质粒, 菌株携带率为75%。不同年代的副溶菌检出的质粒无明显区别(见表3)。其中有5株菌在检出9416bp 同时检出2个以上的不同分子量的质粒。不同菌株携带不同分子量质粒及不同年代菌株质粒的变化, 对分析副溶菌的特性变异及食物中毒事件溯源提供一定的支持技术。

[参考文献]

　　(　)内数据为耐药率(%)

3　讨论

副溶血性弧菌的血清型很多。目前的血清分型为O 抗原为13型, K 抗原为76型。在本文的研究中, 1986年收集的菌株, 其血清型以O 1、O 4为主, 占所检菌株的80. 76%。1999年以后, O3血清群明显增多, 检出率从86年的15. 38%增加到51. 29%,尤其是O 3∶K 6更是占O 3血清群的76. 19%,已成为我省常见的食物中毒株, 且无明显的地域差别。这种变化与有关报道相符[4]。O 3∶K 6血清型在近年来的频繁出现, 与该血清型的毒力较强有关, O 3∶K 6血清型副溶血性弧菌能产生较高水平的耐热溶血素(TDH ), 较其它血清型更能导致腹泻和感染[5]。提示我们应加强检测, 防止副溶血性弧菌O 3∶K 6

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(收稿日期:2005-10-10)

(上接第89页)

诱导产生多重耐药菌。综合上述情况, 临床治疗绿脓杆菌引起的感染选择抗生素时应极为慎重, 必须根据实验室的药敏结果选择药物, 禁止无指征滥用抗生素。

从这些产酶菌的临床分布来看, 主要分布于痰标本和尿标本, 在临床科室的分布中则主要见于I CU , 可能与I CU 的病人抗生素应用较多有关, 这些提醒我们在进行绿脓杆菌的临床分离过程中, 应重点加强对ICU 病房中痰、尿标本的β-内酰胺酶的监测。

[参考文献]

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(收稿日期:2005-09-26)