常用检测方法
一、 荧光免疫检测技术具有专一性强、灵敏度高、实用性好等优点,因此它
被用于测量含量很低的生物活性化合物,例如蛋白质(酶、接受体、抗体)、激素(甾族化合物、甲状腺激素、酞激素)、药物及微生物等。可体外定量检测人血清、血浆、全血或尿液中心肌肌钙蛋白 I、N-端脑利钠肽前体、超敏 C反应蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶、D-二聚体、降钙素原、微量白蛋白的含量,检测结果用于临床辅助诊断。
存在两种模式,即竞争型和夹心型。其中竞争型(以标记抗原的竞争型为例)的测定原理是基于未标记的抗原(Ag)和标记抗原(Ag-L)竞争结合有限的抗体(Ab)而实现的免疫分析法。检测时,Ab和Ag-L的浓度是固定的。当未标记的Ag加到Ab和Ag-L的免疫混合物中后,Ag和Ab的结合使得Ag-L与Ab的免疫复合物的量减少。样品中存在的Ag越多,Ab结合的Ag-L便越少,从Ab-Ag-L免疫复合物的减少或游离Ag-L的增加,可以定量测定出样品中待测抗原的含量。
对夹心型免疫分析来说,其反应原理是在免疫反应的载体上固定过量的Ab,然后加入一定量的Ag,免疫反应后,再加入过量的标记抗体(Ab-L),以形成“三明治”式夹心免疫复合物。样品中存在的Ag越多,结合的Ab-L也越多,夹心免疫复合物的标记荧光信号就越强。 免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术,其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带,当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后,由于毛细管作用,样品将沿着该膜向前移动,当移动至固定有抗体的区域时,样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合,若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色,从而实现特异性的免疫诊断。
二、酶联免疫吸附剂测定法,简称酶联免疫法,或者ELISA法,它的中心就是让抗体与酶复合物结合,然后通过显色来检测。
使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。
三、比色法(colorimetry)是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。比色分析对显色反应的基本要求是:反应应具有较高的灵敏度和选择性,反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定,它和显色剂的颜色差别较大。选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件,是比色分析的关键。常用的比色法有两种:目视比色法和光电比色法。
四、金标法又称免疫金标记技术,是国际上较为先进的灵敏,特异,快速,简便,准确率高的体外诊断方法。测定结果仅凭特制的检验盒在短时间内内即可获得。金标法试纸,抽血后滴在试纸上,用20分钟的时间观察该试纸有无颜色变化。如果有颜色变化,则初检阳。免疫金标技术类似于酶免疫技术,它是用胶体金标记单克隆抗体,作为某些激素的定性或半定量测量。 金标法又分为:层析法和斑点渗透法。层析法一般采用双抗原夹心法免疫测定原理,选择经纯化的基因工程制备的抗原,分别作为包被抗原和胶体金结合抗原。当待检标本中含有HIV抗体时,先和金标记抗原结合,由于层析作用反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动,当遇到包被抗原时,形成Ag-Ab-Ag-Au复合物富集在包被线上,形成红色沉淀线。在包被膜上还有一条质控线对照,故当有两条红线时判为阳性,只有一条红线时,判为阴性。