葡萄籽多糖的提取工艺
63===一
葡萄籽多糖的提取工艺
宋春梅,王珍,张岚,葛红娟
(吉林医药学院公共卫生系,吉林吉林132013)
摘要:以葡萄籽为原料,对粗多糖提取的影响因素及工艺进行研究。采用热水浸提方法萃取葡萄籽多糖,应用苯酚一硫酸法测定多糖含量,分析提取温度、液料比及提取时间对葡萄籽多糖提取的影响,确定提取葡萄籽多糖的最佳
条件和生产工艺。葡萄籽多犍的最佳提取工艺为:提取温度为95cC、液料比为409/L、提取时间为3h,在此条"fCT莆i
萄籽多糖含量为1.36%。提取和测定葡萄籽多糖的方法简便易行,稳定可靠。关键词:葡萄籽;多糖;苯酚一硫酸分光光度法
ExtractionProcessofGrapeSeedPolysaccharide
SONGChun—mei,WANGZhen,ZHANGLan,GEHong-jUall
(DepartmentofPublicHealth,JilinMedicalCollege,Jilin132013,Jilin,China)
Abstract:Withthe
grapeseeds
as
the
raw
material
to
studytheeffectofaffectingfactorsandextractionprocess
water
ofpolysaccharide.Polysaccaridepolysaccharidesandtime
on
was
extractedfromgrapeseedsbyhot
extraction,the
content
oftotal
was
measuredbyphenol—sulfuricacidmethod.Theeffectsoftemperature,liquid-solidratio
were
theextraction
analyzed,thebestconditionandproductionprocessofpolysaccharideextracted
as
fromgrapeseedsweredetermined.Theoptimumtechnicalconditionofpolysaccharidesfromgrapeseedswas
followed:temperature95oC,solid-liqidratio40g/L,time3h.Theyeildofpolysaccharides
was
1.36%underthe
conditions.Themethodofextractionanddeterminationofpolysaccharidesfromgrapeseedsissimple,reliableandstable.
Keywords:grapeseeds;polysaccharide;colorimetryofphenol-sulfuricacid
多糖是生物体内一类重要的大分子,其种类繁多、结构复杂、功能多样,是一切生命有机体必不可少的重要组成成分,与维持生命所必须的生物机能密切相关。多糖有多种多样的生物活性,越来越多的研究证明:多糖是非特异性的免疫调节剂(生物效应调节
基金项目:吉林省教育厅吉教科合字[2011】第285号
作者简介:宋春梅(1964一),女(汉),教授,硕士,从事食物营养与慢性病研究。
剂BRM),它主要影响网状内皮系统(RES)、巨噬细胞(M中)、淋巴细胞、白细胞以及RNA、DNA、蛋白质的合成,cAMP(环化腺苷一磷酸)与cGMP(环化鸟苷一磷酸)的含量,抗体的生成、补体的形成以及干扰素(IFN)的诱生,并具有抗肿瘤[M、抗炎、抗衰老口1、抗凝血、抗病毒、抗放射、降血糖、降血脂等活性[41,而且多糖对机体几乎无毒副作用,随着研究的深入,多糖在医疗上的价值越来越重要,新的用途不断被发现。此外多糖在
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收稿日期:2012—02—15
万方数据
宋春梅,等:葡萄籽多糖的提取工艺
分离提取
日用化妆品方面,在食品工业、发酵工业及石油工业等行业上也有着广泛的应用。
目前多糖的提取方法主要由溶剂提取法、生物提取法和强化提取法等。溶剂提取法主要由水浸醇沉法及酸、碱提取法、超临界流体萃取法嘲。生物提取法主
要采用单一酶或复合酶酶解M,强化法是采用物理强
化法如微波或超声波辅助萃取法。本文主要采用水浸醇沉法,该方法生产工艺成本低,安全,适合工业化大生产,是一种可取的提取方法。
葡萄是世界上产量最大的水果之一,我国每年用于酿酒和其他行业的鲜葡萄估计超过10万t,这样每年我国就有500万kg~700万k譬的副产品葡萄籽。目前国内在酿造过程中葡萄籽作为废弃物被扔到沟
边、路旁,任其发臭变质,造成环境污染及资源的极
大浪费【8]。葡萄籽随着人们对葡萄籽多糖认识的深人,以及葡萄籽利用生产工艺的成熟,在我国必将建起更多的葡萄籽综合开发利用的生产企业,从而促进这一资源的合理开发,同时也为企业带来经济效益。1材料与方法1.1材料与试剂
葡萄籽:市售,粉碎过60目筛;葡萄糖标准品(美国Sigma);苯酚、乙醚、浓硫酸、三氯甲烷、正丁醇、碳酸氢钠、无水乙醇、95%乙醇、丙酮、铝片以上均为分析纯试剂,购自天津市大茂化学试剂厂。1.2仪器与设备
旋转蒸发仪(RE一52AA):上海亚荣生化仪器厂;循环水式多用真空泵(SHB—IIIA):上海豫康科教仪器设备有限公司;电子天平(vnl104N):上海精密科学仪器有限公司;可见光分光光度计(722):上海欣荣仪器有限公司;电热恒温干燥箱(202一lAB):天津市泰斯特仪器有限公司;电热恒温水浴锅(HHS一21—4):上海博讯实业有限公司医疗设备厂;台式低速离心机(TD5A):湖南省凯达实业有限公司。1.3方法
1.3.1粗多糖的提取工艺
葡萄籽粉一脱脂_热水浸提一抽滤一浓缩一加
3倍体积95%乙醇_带置过夜I-—i离心20min(3000drain)
一沉淀水溶后定容一脱蛋白质、脱色-÷测定7
称取1.0g的葡萄籽粉,用乙醚脱脂。脱脂后样品,以水作溶剂,提取液抽滤后,经旋转蒸发仪减压浓缩至15mL。浓缩后的样品中加入45mL95%乙醇至不再产生沉淀,离心。沉淀加水复溶,定容至100mL。加入25mLSevag试剂,充分振荡、离心,取上清液。加入
万方数据
足量涪陛炭,摇匀静置30min,过滤。液体合并,减压浓
缩至30mL,加入100mL95%乙醇,静置过夜,离心,沉淀。沉淀60℃干燥,即得粗多糖。1.3.2单因素试验1.3.2.1提取温度的选择
液料比为30g/L,分别在65、75、85、95℃条件下,提取3h,重复3次,取平均值,确定提取的最佳温度。1.3.2.2液料比的选择
液料比分别为10、20、30、40g/L,提取温度为最佳提取温度,提取3h,重复3次,取平均值,确定提取的最佳液料比。
1.3.2.3提取时间的选择
液料比为最佳液料比,提取温度为最佳提取温度,提取时间分别为1、2、3、4h,重复3次,取平均值。1.3.3正交试验
在单因素试验的基础上,以提取温度、液料比、提取时间为考察因素,采用三因素三水平正交试验,以吸光度为指标,筛选最佳提取条件。正交试验设计表见表1。
表1正交试验设计表
Table1
Designoforthogonaltest
1.3.4多糖含量的测定1.3.4.1标准曲线绘制
葡萄糖标准溶液的制备:精密称取100mg的葡萄糖,加水溶解,定容100mL。取10mL再定容100mL,配成葡萄糖标准溶液。
标准曲线的制作:精密吸取葡萄糖标准溶液0、
0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0
mL,分别置于具塞试管中,加
蒸馏水补足2mL,再各加5%苯酚1mL,混匀,迅速加入5mL浓硫酸,立刻摇匀。放置30min于490nm处测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标,葡萄糖浓度(c)为横坐标,绘制标准幽线,回归方程为:Y=0.018
2X一
0.0513,R2=0.9992。
1.3.4.2多糖含量的测定
取1mL上述过滤后的样品溶液至具塞试管,加蒸馏水补足2mL,再各加5%苯酚1mL,混匀,迅速加入
5
mL浓硫酸,立刻摇匀。放置30min,于490nm处测
定吸光度。
分离提取
宋春梅,等:葡萄籽多糖的提取工艺
1.3.5多糖含量的计算【101
样品多糖含量/%=面M×100
式中:M为葡萄籽粉多糖质量,rag;M0为葡萄籽粉质量,mg。
2结果
2.1单因素试验2.1.1提取温度的选择
提取温度对葡萄籽多糖提取的影响见图1。
≮谜皋签
温厦,℃
图1温度对吸光度的影响
Fig.1
Effectof
temperature
onabsorbance
由图l可知在65℃一85℃温度范围内随着温度升高,吸光度明显增大,但85℃以后变化幅度较小。温度太高会破坏多糖生物活性,色泽加深,黏度增大,提取温度选择85cc为宜。2.1.2液料比的选择
液料比对葡萄籽多糖提取的影响见图2。
O.450.400.350.300.250.20弋毯皋签
O.15O.10O.050.oo
液料比/(g,L)
图2液料比对吸光度的影响
Fi晷2
Effectofliquid-solid
ratioonabsorbance
由图2可知,液料比为409/L时的多糖提取率与10、20、30筠/L之间差别较大,即随着液料比的增加,吸光度值也增加,选取液料比为40g,L。
2.1.3提取时间的选择
提取时间对葡萄籽多糖提取的影响见图3。
0.50r
㈣}/卜\
.,
气髓装签
黜//
0.10提取时间,}l
图3提取时间对吸光度的影响
Fig.3
Effectofextracttime
on
absorbance
万方数据
65==.
表3正交试验结果方差分析表
Table3
One-wayANoVAoforthogonaltest
注:}为p<O.05;}}为p<0.01。
极差分析表明,R3>R,>R2,即对葡萄籽多糖碍率影响最大的因素为提取时间,其次是提取温度,液料比的影响最小。由表3可知,温度、液料比、时间对结果均
有显著陛影响。葡萄籽多糖提取的最佳组合是A,B3C:,
即提取温度为95℃、液料比为40g/L、提取时间为3h。
在此提取条件下所得多糖含量为1.36%。
3讨论
对于动植物及微生物多糖的提取,首先要去表面脂肪[91。由于葡萄籽中富含脂肪酸l彻,应先用石油醚或乙醚去除脂肪。另外葡萄籽提取的粗多糖中含有一定量蛋白质、色素、低聚糖等杂质,应当除去。蛋白去除
=66
宋春梅,等:葡萄籽多糖的提取工艺
分离提取
方法主要由Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法等,Sevag法在避免降解上有较好效果,但效率不高,如能配合加入蛋白质水解酶,再用Sevag法效果更佳。三氟三氯乙烷法效率高,但溶剂沸点较低,易挥发,不宜大量应用。三氯醋酸法会引起某些多糖的降解。对于植物来源的多糖,可能含有酚型化合物而颜色较深,这类色素大多呈负性离子,不能用活性炭吸收剂脱色,可用弱碱性树脂DEAE纤维素来吸附色素;若糖与色素是结合的,易被DEAE纤维素吸附,不能被水洗脱,这类色素可进行氧化脱色:以浓氨水(或NaOH液)调至pH8.0左右,50℃以下滴加H20,,至浅黄,保温2h;一般情况下,尽量避免用活性炭处理,因活性炭会吸附多糖,造成多糖的损失。除低聚糖等小分子杂质方法是通过逆向流水透析除去低聚糖等小分子杂质。这样得到的就是多糖的半精品。多糖的纯化方法较多【11】,有分部沉淀法、季胺盐沉淀法、盐析法、金属络合物法、柱层析、高压液相层析等。
苯酚一硫酸分光光度法测定葡萄籽中多糖含量的原理是葡萄籽多糖在硫酸的作用下,先水解为单糖,单糖迅速脱水形成糖醛衍生物,然后与苯酚结合为有色化合物,在波长490rim处有最大吸收。本法简单,显色稳定,灵敏度高f8】。在5%苯酚溶液配制过程中,尤其是蒸馏苯酚的时候,一定要先把蒸馏分析纯试剂置于40℃~50℃水浴锅中预热一段时间,才能便于试剂的取出;在蒸馏过程中,冷凝管中的水是达到160℃左右的时候才需要慢慢加入的。
本实验采用水提法从葡萄籽中提取多糖,通过正交试验筛选出了提取水溶性多糖的最佳条件:提取温度为95℃、液料比为40g/L、提取时间为3h,在此条
件下采用苯酚一硫酸分光光度法测定其含量为1.36%。温度太高会破坏多糖生物活性,色泽加深,黏度增大,这可能是由于在一定时间内提取时间越长,多糖溶解于热水中就更充分。另外,加热时间长亦会导致多糖发生少量水解。参考文献:
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收稿日期:2012—03—01
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万方数据