实验一蛋白质含量测定方法的研究

实验一 蛋白质含量测定方法的研究

——非蛋白物质的可能干扰及其干扰程度的研究分析

生物111班 杨明轩 1102040128

一、研究背景及目的

蛋白质（protein）是生命的物质基础，它构成细胞结构、参与新陈代谢，与遗传、繁殖、发育等生理活动密切相关。在生物化学和分子生物学等学科的学习和研究中，人们常常需要分析蛋白质的结构组成和功能，特别是在蛋白质组学时代的今天。而分析研究蛋白质这一生物大分子，常常要进行蛋白质的分离、提纯、鉴定，在这些过程中或过程后，又常需对蛋白质的含量进行测定，使其符合自己使用的某一种技术或方法的条件。因而掌握蛋白质含量的测定方法，为今后进行更复杂的研究工作奠定了基础。

本实验的实验目的是：通过对生物体的蛋白质含量的测定，探究可能的“非蛋白的干扰因素”及其在不同测定方法中对蛋白质含量测定的影响，并希望通过本次实验初步得出在测定未知生物体系时，如何选择合适的测定方法，以达到最大程度的降低误差的目的。

二、实验原理

生物化学实验分析的样品为生物样品，不同于纯化学分析，我们必须明确生物样品的复杂性与不可知性。虽然我们分析的每种物质在生物体系中都有确切含量，但没有一种方法可以不受杂质的干扰，将其确切含量测定出来。因此我们需要从现有的分析方法中，找出做合适的方法。目前测蛋白质含量的方法通常采用利用某些物质与蛋白质中的特殊结构发生化学或物理反应而呈现出某种可测的变化来实现。现有的方法包括凯氏定氮法、双缩脲法、Follen—酚法、考马斯亮蓝法和紫外法。这四种方法除凯氏定氮法为经典的测定总氮量的方法外，其他方法均依赖于比色法。

比色法是物质分析中常用的一种方法。简单地说，这种方法以生成有色化合物的显色反应为基础，是一种通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。比色法以朗伯-比尔定律为基础即：

A=εbc，

（A为吸光度，c为待测物质浓度）

依据溶液的光吸收值与其浓度成正比，来确定溶液浓度。这种方法的优点是简单快速，并对样品基本没有消耗。比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。

通过比色法分析蛋白质含量依赖于蛋白质中所含氨基酸的特殊结构对于不同波长光的特异光吸收的量与其浓度成正比，来确定样品中蛋白质的含量是一套较为完善而成熟的技术。但这几种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，不论是凯氏定氮法还是比色法，总会有结构近似的杂质物质干扰试验结果。在实际科研工作中，我们可能要对大量未知生物体系进行蛋白质含量分析，如何选取最为有效、快捷、简单的测定方法就成了我们亟待解决的问题。

紫外法、Folin-酚法和考马斯亮蓝法。各种方法的原理见表1。

方法 紫外法

灵敏度 较为灵敏，50-100g 灵敏度高，5g

时间 快速，5-10min

慢速，40-60min

原理

蛋白质的酪氨酸和色氨酸在280nm有吸收峰。

双缩脲反应，磷钼酸-磷钨酸试剂被酪氨酸和色氨酸还原。 考马斯亮蓝染料在与蛋白质结合时，在595nm有特征吸收峰。

干扰物质 说明

嘌呤、嘧啶、核酸的吸收可矫正。 核苷酸等。 硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸等。

耗费时间长，操作需严格计时，颜色深浅随不同蛋白质而变化。

强碱性缓冲最好的方法，干扰物液、Trition 质少，颜色稳定，颜X-100、SDS色深浅随不同蛋白等。 质变化。

Folin-酚

法

考马斯亮蓝G-250法

灵敏度快速，高，1-5g 5-15mi

n

表1 蛋白质含量测定的各种方法的比较

三、仪器与试剂

实验材料：1mg/ml标准牛血清蛋白溶液、绿豆芽下胚轴、0.5mg/ml左右的标准蛋白溶液

实验试剂：试剂甲、试剂乙、考马斯亮蓝G-250溶液，石英砂 实验仪器：722-光栅分光光度计（上海分析仪器总厂）；UV9600紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；架盘药物天平 JP-100（常熟市双杰测试仪器厂）；具塞试管、刻度试管、小烧杯、移液管、容量瓶、研体、漏斗及漏斗架。

四、实验方法及步骤

1、生物样品溶液（待测液2）的制备 称取1.5g绿豆芽下胚轴（掐头去尾），加入少量石英砂和蒸馏水研成匀浆。用蒸馏水将样品转移至50mL容量瓶中，定容至50mL。颠倒浸提10min，使样品充分混匀。过滤，所得溶液即为待测液2。（过滤所用时间较长，可利用等待的时间进行下面的步骤。）

2、Folin-酚法

1）配制250μg/ml的BSA原液。用移液枪取3ml 1mg/ml的BSA标准溶液，再取9ml蒸馏水于标有250μg/mlBSA试管中，混匀即为250μg/ml的BSA原液。

2）按下表用记号笔标好试管的号数，并用移液枪向各试管中加入相应试剂。

3）加入BSA原液和待测液后，每支试管中用移液枪加入5ml试剂甲，混匀，在室温下静置10分钟。10分钟后，用移液枪向每支试管中加入0.5ml试剂乙，立即混匀，在室温下静置30分钟后在650nm波长下使用可见光分光光度计对其吸光度进行测量（实际操作中由于并列子实验的需要，实际静置时间为80分钟）。以1号管为空白组，调其透光度为100%，吸光度为0。1号管一直放在分光仪中，每次开盖之后都要用其进行校对之后再测其他试管吸光值。

3、考马斯亮蓝G250法：

1）配制100μg/ml的BSA原液。用移液枪取1ml 1mg/ml的BSA标准溶液，再取9ml蒸馏水于标有100μg/mlBSA试管中，混匀即为250μg/ml的BSA原液。

3）加入BSA原液和待测液后，每支试管中用移液枪加入5mlG-250溶液，混匀，在室温下静置2分钟后，在595nm波长下使用可见光分光光度计对其吸光度进行测量（实际操作中由于并列子实验的需要，实际静置时间为20分钟）。以1号管为空白组，调其透光度为100%，吸光度为0。1号管一直放在分光仪中，每次开盖之后都要用其进行校对之后再测其他试管吸光值。

4）再按下表配置相应浓度的溶液，用可见光分光光度计测量其吸光度，用以描绘高浓度考马斯亮蓝法的标准蛋白曲线：

4、紫外法：

2）在280nm波长下对14支试管分别进行吸光度测定；再在260nm波长下对9-14号试管进行测定，以1号管为空白组。调其透光度为100%，吸光度为0

。1号管一直放在分光仪中，每次开盖之后都要用其进行校对之后再测其他试管吸光值。

5、实验后的整理：

实验完成后，将所有玻璃器皿洗净（自来水—洗涤剂—自来水—蒸馏水）；考马斯亮蓝法中的使用的器皿还要用乙醇彻底清洁。将所有器材归位，清洁实验台面。

五、数据处理

5.1 Folin—酚法测量结果

5.2考马斯亮蓝G250法测量结果

G-250法高浓度区测定结果如下：

5.3紫外法测量结果

六、数据处理

（1）Folin-酚法

根据实验得到的数据，以蛋白质浓度为横坐标、OD650值为纵坐标，绘制标准曲线如图1。

由上图，得到曲线的方程为y=0.0021x，回归系数R2=0.9947接近1，说明X、Y线性关系较强即在所测得浓度范围内，溶液的吸光度符合朗伯-比尔定律，吸光度和蛋白质溶液浓度基本呈线性关系，BSA因此可以用作标准曲线。

实验中的得到的7、8、9号试管中溶液及10、11、12号试管中的吸光度的平均值分别为0.249、0.291，带入直线方程，得到两溶液中蛋白质浓度分别为103.61μg/mL，121.11μg/mL。由于7、8、9号试管中溶液是由待测液1稀释5倍而来，因此待测液1的蛋白浓度为518.06μg/mL。按照要求，将待测液2的蛋白浓度换算成样品中的蛋白百分含量，公式为

样品中蛋白质含量(%)=

蛋白质含量(μ ) 样品总体积( )

样品重( ) 106

100%

=

121.111 50

100%=4.04%

（2）考马斯亮蓝（G-250）法

根据实验得到的数据，以蛋白质浓度为横坐标、OD595值为纵坐标，绘制标准曲线如图3。

图2 考马斯亮蓝（G-250）的标准曲线

由上图，得到曲线的方程为y=0.0086x，回归系数R2=0.9922接近1，说明X、Y线性关系较强，即在所测得浓度范围内，溶液的吸光度符合朗伯-比尔定律，可以用作标准曲线。实验中的得到的7、8、9号试管中溶液，10、11、12号试管中的吸光度的平均值分别为0.395、0.149，带入直线方程，得到两溶液中蛋白质浓度分别为45.93μg/mL，17.40μg/mL。由于7、8、9号试管中溶液是由待测液1稀释10倍而来，因此待测液1的蛋白浓度为459.3μg/mL。按照要求，将待测液2的蛋白浓度换算成样品中的蛋白百分含量，公式为

样品中蛋白质含量(%)=

蛋白质含量(μ ) 样品总体积( )

样品重( )

106

100%

=

21.434 50

100%=7.1%

同时将考马斯亮蓝高浓度范围内测定得到的数据按照上面的方法作图，得到如下图3。

图3 考马斯亮蓝（G-250）高浓度范围的曲线

由图3可以看出，在蛋白质浓度较高时，考马斯亮蓝（G-250）法测定的吸光度与蛋白浓度不再成线性，即不再符合朗伯-比尔定律，因此在蛋白质浓度较高时，不再适合使用考马斯亮蓝法来测定其含量。

（3）紫外法

根据实验得到的数据，以蛋白质浓度为横坐标、OD280值为纵坐标，绘制标准曲线如图4。

图4 紫外法的标准曲线

由上图，得到曲线的方程为y=0.5844x，回归系数R2=0.9999接近1，说明X、Y线性关

系较强，即在所测得浓度范围内，溶液的吸光度符合朗伯-比尔定律，可以用作标准曲线。 另将实验中得到的待测液1 OD280的平均值为0.279带入直线方程，得到待测液1中蛋白质浓度分别为0.477mg/mL。待测液1的OD260为0.170，OD280/OD260为1.639，因此校正因子

F取1.081，带入经验公式

蛋白质浓度( ⁄ )=F d