1关于吡啶类农药降解方面的综述
关于吡啶类农药降解方面的综述
摘要
吡啶类农药的降解包括吡啶的缺氧降解,各种菌生物降解,光解等。其中包括在UV - TiO2 体系中对吡啶( PD) 进行光催化降解, 共基质条件下脱氮副球菌W12降解吡啶,含氮杂环化合物吡啶的缺氧降解,生物沸石降解吡啶,链菌霉对吡啶的降解,焦化废水吡啶降解菌降解吡啶,缺氧反硝化降解吡啶,瘤胃细菌降解有毒的吡啶化合物,广州苍白杆菌降解嘧啶等。
关键词:吡啶;降解;降解菌;农药
前言
近年来随着农药的大量使用,人们越来越关注它们对环境产生的影响。当农药在田间喷洒至土壤表面、水体和植物表面之后,它们将在自然环境中经历生物降解、水解以及光解过程,在这些变化的过程中往往会对环境产生负面的影响,因此在农药进入市场之前,必须进行其环境行为的研究。
其中吡啶是具有代表性的6元含氮杂环化合物,广泛存在于焦化和制药废水中,且易溶于水,在水中具有较好的化学稳定性,通过扩散极易进入地下水系统。吡啶呈中度急性毒性,有明显的致畸变性,对人类的健康构成潜在的威胁,有必要探明吡啶在废水生物处理过程中的毒性变化规律。生物降解是吡啶类农药降解的重要研究内容,过去研究主要集中在寻找可以降解吡啶类化合物的微生物的研究中,其中包括脱氮副球菌W12降解吡啶,生物沸石降解吡啶,链菌霉对吡啶的降解,焦化废水吡啶降解菌等。
鉴于总结嘧啶降解的工作将对今后吡啶类农药降解的研究意义以及降低农药对环境污染的现实应用意义,就吡啶类农药降解的关键问题进行了系统的分析和综述。
1 吡啶类化合物的光降解
1.1 在UV - TiO2 体系中对吡啶( PD) 进行光催化降解
( 1) Al2O3的制备: 将偏铝酸钠、氯化铝、硫酸铝溶于水, 用HCl 、NaOH 调节pH=7左右, 用热水洗去盐类, 离心, 取胶体, 100 ℃ 烘干, 一定温度焙烧1 h. 将硫酸铝铵在马弗炉中一定温度焙烧1 h, 制得超细γ- Al2O3.
(2) Al2O3负载TiO2:
溶胶的制备: 以钛酸四丁酯为原料, 无水乙醇为溶剂, 二乙醇胺作抑制剂, 按照Ti(OC4H9) 4:C2H5OH:H2ONH( C2H5OH) 2= 1:26. 5:1:1( 摩尔比) 制成溶胶. 将溶胶自然干燥得凝胶, 于马弗炉内500 ℃ 焙烧一个小时得粉体样品.
负载过程: 称取一定量Al2O3 放入一薄壁坩埚中, 加入一定量溶胶, 超声振荡10 min, 100℃烘干, 500℃焙烧1 h. 可进行多次负载, 本文采用负载1 次,H2O3 显色- 光度法, 测得TiO2 负载量为13.86 %.
(3) 光催化降解实验:配制吡啶溶液时, 先将水通空气溶解饱和( 经碘量法测定DO 为8. 8 mg / L) . 实验装置为自制石英玻璃管, 长450 mm, 内径15 mm 。
量取40 ml 一定浓度的吡啶溶液于石英管中, 加入一定量负载型TiO2, 两端密封. 将石英玻璃管固定在HY- 4 型多用振荡器上, 以一定速度振荡. 调整灯至液面距离为10 cm. 间隔取样, 离心分离后取上清液分析测定. 吡啶用巴比妥酸显色光度法, 在520 nm 处测定, 氨氮经纳氏试剂显色在410 nm 处测定.
吡啶降解率Nt = ( P0- P) / P0 x100 % , 式中Nt 为t 时刻吡啶降解率,P0 为起始时刻吡啶浓度, P为t 时刻吡啶溶液浓度(mg/L). [14]
1.2 顺式硝基亚甲基四氢吡啶类新烟碱化合物的光降解
(1)主要仪器
XPA 系列光反应仪(南京胥江机电厂) ; Brucker AV-400(400MHz)核磁共振仪;MicroMass GCTCA055质谱仪,EI 源; Agflent 1200液相色谱仪,二极管阵列(DAD)检测器;GC —MS :Agilent 7890A气相色谱,HP 5975C,Vafian Cary 100 Bio型UV-Vis 紫外可见分光光度计,LC —MS Agilent 6210 TOFMS。
(2)试剂
用于HPLC 和LC —MS 分析的乙腈为色谱纯,二次蒸馏水,吡虫啉(购于江苏克胜集团股份有限公司) ,IPPAl52001和IPPAl52004标准品(自制,含量≧99.0%,
通过元素分析) 。
(3)光降解实验
用双蒸水准确配制吡虫啉、IPPAl52001和IPPAl52004为l ×10一5mol /L 、5 ×10。mol /L 溶液,分别置于石英试管中在300W 高压汞灯,500W 氙灯和配有365nm 滤光片的300W 高压汞灯下照射,以铝箔包裹作为黑暗对照。每隔一定时间取样lml ,4E 冰箱中保存,在尽量短的时间内对光反应液进行HPLC 分析。
用双蒸水准确配制IPPAl52001和IPPAl52004溶液250ml(1×10-4 mol/L) 置于石英试管中,在300W 高压汞灯下照射,每隔一定时间取样10 ml进行UV 分析。
用双蒸水配制IPPAl52004溶液100ml(1×10-3 mol/L) 每隔一定时间取样2ml 进行LC —MS 分析。待光照17小时后将剩余溶液取出冻干,用lml 甲醇溶解进行GC —MS 分析。
2.3分析方法
2.3.1 UV分析方法
扫描紫外光谱范围:200—500hmI 扫描速率:600nm /min 。
2.3.2 HPLC分析方法
色谱柱:Zobarx XDB —C18(5 um ,250 mm x 4.6 mm) 。柱温:25℃。流速:l ml /min 。对于吡虫啉、IPPAl5200l 和IPPAl52004的紫外检测波长分别为:270、325、345 nm ,手动进样,20 ul 的定量环,每次进样量为50ul 。样品均采用梯度洗脱方法,HPLC 流动相比例见表l 。
在此分析条件下,吡虫啉、IPPAl52001、IPPAl52004 Nol和IPPAl52004 N02(IPPAl52004 Nol和IPPAl52004 N02为一对差向异构体) 的保留时间分别为
9.875、10.825、9.053和13.552 min。
2.3.3 GC—MS 分析方法
氦气载气流速:1.2 ml/minl 程序升温:80℃(保留4分钟) 以8℃/min 的升温速率升至260℃,保留5分钟,然后再以8℃/min 的升温速率升至300C 保留17分钟;进样温度:300℃进样体积:lul(无分流)l EI电离电压:70 eV质荷比扫描范围:50—800u .
2.3.4 LC—MS 分析方法
色谱柱:Zobarx XDB—C18(5un,150 mmX4.6 mm),柱温:30℃。流动相:水A(O.015%甲酸) :乙腈B ,梯度洗脱,0min A :100%,B :0%;10min A :100%,B :0%; 40min A :80%,B:20%; 50minA :80%,B :20%l 70min A :40%,B :60%; 90min A :0%,B :100%。流速:0.5 ml /min ,紫外检测波长:265nm ,
进样量为20 u l。
离子源:电喷雾离子化(ESI源) ,扫描方式:正离子方式扫描;静电喷雾电压:3000 V ;去溶剂气温度:350℃去溶剂气流速:6 l /min ;喷雾气压力:50 ps i ;分离器电压:60V 碎裂电压:250V; 质荷比扫描范围:50—400Da ,数据分析采用Agilent MassHunter Workstation version B.01.03定性分析软件。[1]
2 生物菌降解吡啶类化合物
2.1 共基质条件下脱氮副球菌W12 对吡啶的降解
(1)菌种来源
从实验室的废水生物处理反应器内采集活性污泥样本, 以吡啶为唯一碳、氮源筛选出来一株细菌, 编号W12。
(2)降解实验方法
投加菌制备。向600mL 的LB 液体培养基中接种W12 菌, 加入0. 3mL 的吡啶防止杂菌的污染及保持菌生长活力, 富集培养36 h 。菌液离心后, 用无菌水清洗3 次, 以去除LB 培养液及一些代谢产物和杂质, 再用45 mL 的液体无机盐培养基重悬菌体, 制备成菌悬液。
降解实验过程。各加1mL 的菌悬液至含有一定浓度的吡啶和葡萄糖/ 苯酚/ 喹啉的液体无机盐培养基中, 终体积为100mL 。封口膜密封, 在35℃, 180r/ min 下振荡培养, 每隔一定时间取少量样品, 经0.45um 滤膜过滤后, 对滤液进行水质分析。
(3)分析方法
吡啶及喹啉浓度通过高效液相色谱( 岛津LC10ADVP , SPD10AVP U V-V is Detector;Diamo nsil C18 色谱柱, 柱高250mm, 直径4. 6mm,入口直径5 um) 测定。流动相组分的体积比为V ( 甲醇) ∶V ( 水) = 4∶1, 体积流量为1 mL/ min; 吡啶检测波长为254 nm; 喹啉检测波长为275 nm, 进样体积均为10 uL。苯酚浓度用4-氨基安替比林直接光度法测定。
投菌量以菌干重为计, 测定方法: 取10 mL 制备好的菌悬液, 5 000 r/ min 下离心5min 后, 倒掉上清液, 将装有底部菌体的离心管放在烘箱中, 在105℃下烘干后, 取出放在干燥器中冷却后称重, 再放入烘箱中, 反复称重直至恒重。
结合1. 2 降解实验过程的制备, 投菌量为
M=(m1−m2) V2V1V3.
式中: m1 为总质量; m2 为离心管的空质量; V 1 为菌悬液的体积; V 2 为投加到反应体系中的菌液体积; V 3 为反应体系的终体积。[16]
2.2 焦化废水吡啶降解菌的筛选及降解
(1)实验设备
实验设备采用SPX-250B-Z 型生化培养箱;HZ200LB 型恒温摇床; 3K30 型冷冻离心机; T6 新世纪紫外可见分光光度计。
(2) 培养基
富集培养基(g/L): 蛋白胨10.0, 葡萄糖1.5,酵母膏3.5, NaCl 9.5。 LB 培养基( g/L) : 酵母膏5.0, 蛋白胨10,NaCl 10.0。
MSM (g/L): K2HPO4 5.0, KH2PO4 2.0, NaCl2.0, MgSO4·7H2O 0.2, NH4Cl 1.0, 酵母膏3.0, pH为7.2-7.6。
(3) 优势菌筛选
将武钢焦化曝气池污泥接种到含吡啶浓度200mg/L 富集培养基, 于30℃、150r/min 摇瓶培养5d 后, 取少量菌液加入到新鲜的吡啶MSM 中, 同样条件培养, 如此反复驯化5 个周期筛选菌株(吡啶的浓度逐步由200mg/L 增加至1 200mg/L, 酵母膏和NH4Cl 的浓度逐渐降为零) 。取驯化后的培养液, 涂布在吡啶无机盐梯度平板上培养, 并挑选清晰的菌落, 经平板划线直至获得单一菌落, 分别考察各单一菌株对吡啶的降解能力, 筛选1 株优势菌于4℃保存备用。
(4)菌悬液制备
将菌株在含吡啶浓度500mg/L 的MSM 中振荡培养24h 后, 4 000r/min 离心30min 收集菌体, 用0.5%的无菌盐水反复洗涤3 次, 同样条件下离心,再将菌体溶于0.5%无菌盐水配成菌悬液, 于4℃保存备用。[2]
(5)菌株鉴定
菌体形态用光学显微镜观察, 对分离纯化得到的菌株进行革兰氏染色和生理生化特征实验, 根据文献[6] 进行初步鉴定。
(6)分析方法
采用分光光度计测定培养液在600nm 处吸光度值OD600, 以评价细菌的生长情况。吡啶浓度采用分光光度法测定: 将4℃保存的菌悬液加到含吡啶的MSM , 按
中30℃、150r/min培养后, 于4℃、12 000r/min 离心10min , 再以乙酸乙酯萃取上清液, 最后在特征波峰256nm 处测定吸光度, 根据吡啶的浓度———吸光度标准曲线,确定吡啶浓度, 进而计算降解率。
(7)吡啶降解实验
在装有100mL MSM 培养基的锥形瓶中, 研究菌株生物降解特性, 探讨随吡啶初始浓度、温度、pH 值和金属离子的改变吡啶降解率的变化趋势。
2.3 脱氮副球菌W12降解吡啶
(1)菌种来源
从实验室的废水生物处理反应器内采集活性污泥样本, 以吡啶为唯一碳、氮源筛选出来一株细菌, 标号W12, 经菌种鉴定, 为脱氮副球菌.
(2)降解试验方法
投加菌制备: 向100 mL的LB 液体培养基中接种W 12菌, 加入50 L 的吡啶(吡啶浓度大概为500Mg xL- 1 ) 防止杂菌的污染及保持菌生长活力, 富集培养36 h. 菌液离心( 5000 rxm in- 1, 5m in)后, 用无菌水清洗3次, 以去除LB 培养液及一些代谢产物和杂质, 再用25mL 的液体无机盐培养基重悬菌体, 制备成菌悬液.
降解实验过程: 各加1mL 的菌悬液至含有一定浓度吡啶的液体无机盐培养基中, 终体积为100mL. 封口膜密封, 在35℃, 180 r xm in- 1条件下振荡培养, 每隔一定时间取少量(一般取0. 1 mL) 样品用0. 45um 的滤膜过滤后, 对滤液进行分析测定.
(3)分析方法
吡啶浓度通过高效液相色谱(岛津LC10ADVP,SPD10AVP UV -V is Detector; D iamonsil C18 色谱柱,250mm x 4. 6 mm, 5 um ) 测定. 流动相为V 甲醇:V水= 4:1, 流速为1 mL xm in- 1; 吡啶检测波长为254nm; 喹啉检测波长为275 nm, 进样体积均为10 L.
菌密度OD602用分光光度计测定. OD ( opticaldensity)表示被检测物吸收掉的光密度, 以此来代表菌的生长情况.
投菌量以菌干重计. 测定方法: 取10mL 制备好的菌悬液, 5000 rxmin- 1下离心5 m in后倒掉上清液, 将装有底部菌体的离心管放在烘箱中, 在105℃下
烘干后, 取出放在干燥器中冷却后称重, 再放入烘箱中, 反复称重直至恒重. 结合2. 2节降解实验过程的制备, 投菌量M 的计算如公式( 1)所示.
M =(w1−w2) v1v2v3式中, W1 为总重量( g) , W2 为离心管的空重量( g) ,V1 为菌悬液的体积( mL) , V2 为投加到反应体系中的菌液体积(mL) , V3 为反应体系的终体积(mL) .
(4)质粒提取方法(萨姆布鲁克等, 2002) [14]
用LB 培养基富集培养W12菌36 h, 离心去上清后用P1溶液( 50 mmol· L- 1 Tris base, pH 8. 0; 10mmol·L- 1EDTA; 100 ug·mL- 1 RNase A )溶解菌体; 加入P2溶液( 200mmol·L- 1 NaOH; 1% SDS ), 轻柔颠倒混匀, 室温放置5 m in; 加入P3 溶液( 3. 0mol·L- 1 乙酸钾, pH 5. 5) , 轻柔颠倒混匀, 冰浴20min, 离心后取上清液, 用酚 仿抽提, 离心后取上清液, 用异丙醇沉淀DNA, 离心后小心地倒出液体, 晾干后加入70% 乙醇, 已去除沉淀的盐类, 离心后小心倒出液体, 晾干至乙醇挥发干净, 加入TE 溶液( 10 mmo l! L- 1 Tris base, pH = 8. 0; 1 mmo l·L- 1EDTA )溶解质粒DNA.
(5) 脉冲场电泳
在分子生物学中, 琼脂糖凝胶电泳是一项常用的技术, 可是普通的琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA 的范围在50 kb 之内, 而无法分离大片段的DNA( Fangman, 1978; H ersch leb, 2007) , 针对这一现象,Schw artz等( 1983; 1984)发明了脉冲场电泳, 其分离的片段最高可达到10Mb. 脉冲电泳是在琼脂糖凝胶上外加正交的交变脉冲电场, 其方向、时间与电流大小交替改变, 每当电场方向发生改变, 大分子的DNA 便滞留在爬行管内, 直至沿新的电场轴重新定向后, 才能继续向前移动, DNA 分子越大, 这种重排所需时间就越长. 当DNA 分子变换方向的时间小于脉冲周期时, DNA 就可以按其分子量大小分离开(付晓燕等, 2006) .
本研究中脉冲电泳仪使用B io-R ad CHEFMAPPERTM XA. 脉冲条件: 1%
Agarose ( C ertified megabase agarose, Bio-Rad) ; 23:52 h 电泳, 120角度,6 V · cm- 1, 0.5xTBE, 14℃. 电泳完后取出胶, 用SYBR-GOLD 染色30 min , 在紫外透射仪上成像.
(6) 质粒消除及抗性试验
质粒作为独立于染色体之外的能够自主复制的遗传因子, 在细菌中广泛存在, 细菌的某些表型特征, 包括抗性、代谢能力、致病性、共生现象、接合转移
等往往由质粒控制(吴乃虎, 1998). 为了研究W12菌赋存的质粒与W 12具有降解吡啶的能力之间的关系, 做了质粒消除试验. 目前, 质粒消除的常用方法有嵌合染料法和冻融法(娄恺等, 2002) , 前者包括吖啶橙( Trevors, 1986;
Mesasetal. , 2004;李钧敏等, 2005)和溴化乙锭(Cramerietal,1986) ,SDS法( Jungmannetal. , 1987; M ansi et al. , 2000).
质粒消除方法: 实验采用吖啶橙和SDS 分别作为消除剂对菌体进行质粒消除. 首先, 将菌富集培养后接种至一系列含有不同浓度消除剂的LB 培养基内, 放置于180 r!m in- 1、35 条件下的摇床内培养48 h. 将上述培养液分别平板划线接种至LB 固体培养基上, 在培养箱内35 下培养48 h, 确定菌株能够在LB 液体培养基内耐受消除剂的最高浓度. 将能够耐受消除剂最高浓度的菌株再进行质粒提取实验, 确定其质粒DNA 是否被消除. 质粒消除后降解性能的比较: 将质粒消除后的菌在LB 培养基中富集培养后接种至含有500mg ·L- 1 吡啶的无机盐培养基中, 放置于180r ·min- 1、35℃条件下的摇床内培养, 每隔一定时间
取样测吡啶浓度.
质粒消除后抗性的对比试验: 将质粒消除后的菌划线至含有200mg ·L- 1的壮观霉素的LB 固体培养基上, 放置于35℃的恒温培养箱中.
2.4 固定化胶质红环菌降解吡啶
(1)菌种及其固定化方法
实验所用菌种扩大培养采用YP 培养基, 其配方为:酵母膏3 g,蛋白胨3
g;MgSO4·7H2O 0. 5g; CaCl2 0. 3 g;自来水1 000 mL。
培养条件:光照厌氧条件下, 光照度为1 000~3 000 lx, 温度为28~35 ℃, pH 为6. 5~7. 5,培养一周。
固定化方法:利用凝聚剂碱式氯化铝将培养好的菌体聚集在一起, 每100 mL 菌液中加入15mg 的碱式氯化铝, 再加入0. 7%戊二醛处理, 交联后, 沉淀4h, 将上清液倒掉, 留下的絮状物即固定化胶质红环菌。解毒活化:将固定化胶质红环菌用0. 85%的生理盐水冲洗几次, 然后曝气12~24 h备用。
(2)水质
取分析纯吡啶(比重为0. 98 g/mL) 1. 02 mL于250 mL的容量瓶中, 加蒸馏水定容于250 mL刻度, 配制成4 000 mg/L 吡啶溶液, 使用时稀释。
(3)分析方法
吡啶浓度测定采用751 - 紫外分光光度计, 紫外吸收测定波长采用256 nm,氨氮的测定采用纳氏试剂比色法。
2.5 副球菌BW001 的生理特性及其对吡啶的降解
(1) 试 剂
吡啶色谱标样(Chemservice 公司) ; 胰化蛋白胨、酵母浸粉(Oxoid 公司) ; 细菌基因组DNA 提取试剂盒、Taq DNA 聚合酶; 聚合酶链反应( PCR) 引物; 限制性内切酶EcoR Ⅰ、B amH Ⅰ、Hi nd Ⅲ(NEB公司) ;其他试剂均为国产分析纯。
(2) 培养基
菌株分离与纯化采用无机盐培养基(MSM) [25]13 ,其组成为: Na2 HPO4 ,1. 42 g/ L ; KH2 PO4 ,1. 36 g/ L ;MgSO4 ·7H2O , 0. 216 g/ L ; CaCl2 , 0. 006 g/ L ;H3BO3 , 1. 16 mg/ L ; ZnSO4 ·7H2O , 1. 15 mg/ L ;MnSO4 ·H2O ,
1. 69 mg/ L ; CuSO4 ·5H2O , 0. 38mg/ L ; CoCl2 ·6H2O , 0. 24 mg/ L ; NaMoO4 ·2H2O ,0. 024 mg/ L ; FeSO4 ·7H2O , 2. 78 mg/ L 。菌株固氮特性检测采用阿须贝无氮培养基[26 ] , 其组成为:C7 H12O6 ,10 g/ L ; KH2 PO4 ,0. 20 g/ L ;MgSO4 ·7H2O ,0. 200 g/ L ;NaCl ,0. 2 g/ L ;CaSO4 ·2H2O ,0. 1 g/ L ;CaCO3 ,5 g/ L 。菌株富集培养采用LB 培养基[27 ] 。制作固体培养基时, 需投加1. 8 %~2. 0 %(质量分数, 下同) 的琼脂; 制作半固体培养基时, 则投加0. 5 %琼脂。培养基在使用前均以121 ℃高压蒸气灭菌20 min 。
(3) 菌株分离与纯化从武钢焦化厂废水处理系统的曝气池活性污泥中分离获得1 株能以吡啶为唯一碳、氮源的高效降解菌BW001 。具体方法为: 先对活性污泥培养驯化, 溶液体系为MSM 中添加一定量的吡啶, 采用恒温摇床培养。驯化共进行3 个周期, 每个周期为5 d , 3 个周期中吡啶质量浓度分别为200. 0、300. 0、300. 0mg/ L 。对驯化后的活性污泥采用平板涂布分离法对其优势菌株进行分离, 选用添加500. 0 mg/ L吡啶的MSM 固体培养基。从培养好的平板中挑取单个菌落, 再以平板划线纯化法对菌株进行纯化。
(4) 菌种鉴定
以16S rRNA 基因序列分析进行菌种鉴定。具体方法为: 提取菌体总DNA ; 将收集到的菌体总DNA 进行PCR , 选用27F ( 5 ’A GA GTTTGA T2CA TGGCTCA G3’)
及1492R ( 5 ’TACGGTTAC2CTTGTTACGACTT3’) 为引物进行杂交扩增; 对PCR 产物进行测序; 应用GenBank 中BLAST 软件进行基因序列同源性比较, 将相似性较高的菌株采用MEGA3. 1 软件包中的邻接法, 构建系统发育树, 从而确定菌株的种属。
(5) 生理特性研究
通过扫描电镜( FEI Quanta 200型) 观察BW001的形态。对该菌的革兰氏染色性质、运动性和固氮能力等生理特性进行考察, 其中运动性的考察是采用LB 半固体培养基穿刺培养法, 从细菌的扩散情况来判断细菌的运动能力; 固氮能力的考察是采用涂布法将稀释后的菌液均匀涂布于阿须贝无氮固体培养基上, 于30 ℃恒温培养箱培养2~3 d ,观察菌体生长状况。
(6) 抗生素敏感性测试
将一定浓度的菌悬液涂布于带有抗生素的LB 固体培养基及空白对照LB 固体培养基(无菌对照组) 上, 以菌体的生长状况作为敏感性或耐药性的判定标准。选用的抗生素有头孢、卡那霉素、利福平、氨苄青霉素、氯霉素、四环素和壮观霉素等7 种。
(7) 菌株质粒赋存情况研究
将菌株接种于LB 液体培养基中,30 ℃恒温振荡摇床培养48. 0 h , 将菌体收集于1. 5 mL Eppen2dorf 管, 用SDS 碱裂解法对菌株质粒进行小规模提取, 用1 % ( 质量分数) 琼脂糖凝胶电泳分离, 经SYBR Gold 染色后, 用凝胶成像仪(UVP GDS28000型) 观察。用3 种限制性内切酶EcoR Ⅰ、B amH Ⅰ、Hi nd Ⅲ对所提取的质粒进行单酶切, 以确定质粒上的酶切位点, 以1 %琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段, 经SYBR Gold 染色后, 用凝胶成像仪观察。
(8) 吡啶降解实验
在进行吡啶降解实验前需富集BW001 菌。具体方法:将LB 富集培养液2 000 mL 分装入6 个500 mL 三角瓶内, 以无菌操作方法向培养液添加500. 0 mg/ L吡啶并接种BW001 菌; 在恒温振荡摇床(30 ℃,180 r/ min) 上培养48. 0 h ;将培养后的纯菌液全部离心(4 000 r/ min ,10 min) ;以无菌MSM 液体重悬, 再离心, 如此反复两次, 最后以无菌MSM 将菌体稀释至50 mL 备用。
吡啶降解实验利用恒温振荡摇床进行。反应体系由无菌MSM 添加一定浓度的吡啶组成, 以无菌操作方法向培养液添加一定量的BW001 菌液, 在选定的温度、转速为180 r/ min 的条件下振荡培养。降解过程中测定菌密度与吡啶浓度的
变化。
(9) 分析方法
接种菌的投加量以干重法测定, 将菌悬液于105 ℃烘干24. 0 h 后称重得到菌的干重; 并以分光光度计(岛津UV2401 型) 测定菌液在最佳波长602nm 处的吸光度(OD602 ) ,代表菌密度, 建立OD602 与菌干重的相关曲线。
p H 测定采用Thermo Orion 868 p H 计。
吡啶浓度采用高效液相色谱仪(岛津LC210AD 型, 带SPD10AVP 紫外可见检测器) 测定, 色谱柱为Diamonsil C18、5μm 反相柱, 250 mm ×4. 6 mm(DIKMA 公司) ; 流动相为甲醇∶水= 4 ∶1 (体积比) ,流速为1. 0 mL/ min ;检测波长为254 nm 。测试样品需经0. 45μm 滤膜过滤, 高浓度吡啶进样体积为5μL , 低浓度吡啶进样体积为10 μL 。吡啶降解的有机中间产物以气相色谱/ 质谱联用仪(Agi2lent 6890N GC/ 5973 MSD 型) 进行定性分析; 毛细管柱为DB25MS ,30 m ×0. 25 mm ×0. 25μm 。样品经二氯甲烷等体积萃取, 用无水硫酸钠过滤后上柱分析, 色谱柱升温程序为:初始温度为40 ℃, 保持2min , 以6 ℃/ min 的速度升温至280 ℃, 保持2 min ;离子源温度为250 ℃, 电子能量为70 eV 。吡啶降解的氮产物(氨氮) 采用氨氮检测盒(QUAN TOFIX型,Sigma2Aldrich 公司) 测定。
2.6 吡啶降解菌的生物降解
(1) 菌株来源
经农药厂污水长期浸泡的土壤。
(2) 培养基
分离筛选培养基: 修改的A TCC 的1780 号降解培养基( 简称178021 ) : K2 HPO4 0. 61 g/ L ,KH2 PO4 0. 39 g/ L , KCl 0. 25 g/ L , MgSO4 ·7H2O0. 13 g/ L , 酵母提取物0. 15 g/ L , 微量元素液1. 0mL/ L , 其中每1. 0 L 微量元素液包括CaCl2 ·2H2O0. 4 mg , FeSO4 ·7H2O 40 mg , MnSO4 ·4H2O 40mg , ZnSO4 ·7H2O 20 mg , CuSO4 ·5H2O 5 mg ,CoCl2 ·6H2O 4 mg , NaCl 1. 0 g , Na2MoO4 ·2H2O5mg , p H 自然。固体培养基为添加15 g/ L 的琼脂。吡啶的添加浓度根据实际分离情况确定。
保藏培养基: 普通细菌LB 培养基: 胰蛋白胨10 g/ L , 酵母提取物5 g/ L , NaCl 10 g/ L , p H =7. 2 。
富集培养基: 普通细菌LB 培养基, 其中添加1. 0 g/ L 吡啶。
降解培养基: 修改的A TCC 的1780 号降解培养基(简称178022) : K2 HPO4 0. 61 g/ L , KH2 PO40. 39 g/ L , KCl 0. 25 g/ L , MgSO4 ·7H2O 0. 13 g/ L ,微量元素液1. 0 mL/ L , 其中每1. 0L 微量元素液包括CaCl2 ·2H2O 0. 4 mg , FeSO4 ·7H2O 40 mg ,MnSO4 ·4H2O 40 mg , ZnSO4 ·7H2O 20 mg , CuSO4·5H2O 5 mg , CoCl2 ·6H2O 4 mg , NaCl 1. 0 g ,Na2MoO4 ·2H2O 5 mg , p H 自然。固体培养基为添加15 g/ L 的琼脂。吡啶的添加浓度根据实验需要确定。
(3) 菌株分离
将采集的样品接种到含有200 mg/ L 吡啶的178021 液体筛选培养基, 于25 ℃, 180 r/ min 下振荡培养一个月, 期间吡啶浓度每隔一定时间逐渐增加, 最终投加浓度达到800 mg/ L , 然后将富集液稀释涂布到含吡啶(浓度为200 mg/ L) 的固体178021 的分离培养基上, 25 ℃, 恒温培养2 d , 长出明显可见的菌落。挑取单菌落在同样的固体平板上划线纯化, 通过LB 液体培养基富集后接于降解培养基复筛, 最终得到降解效率高的纯菌株。
(4) 菌株鉴定
采用细菌通用引物27F ( 5′2 A GA GTTT2GA TCCTGGCTCA G23′) 和1492R ( 5′2 TACCTT2GTTACGACTT23′) 直接扩增基因组DNA 中的细菌16S rDNA 片段(引物由上海英骏生物技术有限公司北京实验室合成) 。先用基因组提取试剂盒
( TianGEN Bio TECH (BeiJ ing) Co. , Ltd. ) 提取所有菌株的基因组DNA , 然后进行PCR 扩增, 扩增反应体系: DNA (约50 ng/ uL) 0. 5μL , 稀释10 倍的Taq DNA 聚合酶Buffer (含有Mg2 + ) 2. 5μL ,dN TP(10 mmol/ L) 1μL , 引物27F 和引物1492R(10μmol/ L) 各0. 5μL , TaqDNA 聚合酶(2. 5 U/μL) 0. 25μL (北京泽星生物科技有限公司) , 补水至25μL 。反应条件: 95 ℃变性5 min ; 再接94 ℃1min , 55 ℃1 min , 72 ℃ 1. 5 min , 30 个循环; 最后72 ℃延伸10 min ( PCR 仪为美国MJ PTC2225) 。扩增产物直接用引物27F 测序(北京诺赛基因组研究中心有限公司) 。测序结果提交于NCBI 的Genbank 数据库中进行比对分析。
(5) 静息细胞降解实验
菌体在富集培养基中生长至最适菌龄, 4 000 r/min 、10 min , 离心收集菌体, 然后用不含吡啶的178022 洗涤、收集, 接于降解培养基(178022) 中, 吡啶初始浓度为400~500 mg/ L 左右, 隔一定时间取样, 测定吡啶残留浓度, 以不接菌
的样品作为空白对照。[18]
(6) 菌体利用吡啶为唯一碳源、能源和氮源的验证
从保藏斜面上挑取菌落接于含有一定浓度吡啶的降解培养基(178022) 中, 隔一定时间取样, 测定OD600和吡啶残留浓度。
(7) 非静息细胞降解实验
用7~8 mL 不含吡啶的178022 的溶液悬浮保藏于斜面中的菌体, 控制OD600 (用分光光度计在波长为600 nm 处所测得的光密度(optical density) ) 在1. 0~
2. 0 之间, 然后吸取1 mL 菌悬液接于5 mL含有不同浓度吡啶的降解培养基
(178022) 中, 隔一定时间取样, 测定OD600和吡啶残留浓度, 绘制生长曲线和吡啶降解曲线, 以不接菌的样品作为空白对照。
(8) 降解速率的计算
吡啶降解速率为
μ =ρ1−ρ2
t2−t1式中:ρ1 为t1 时刻的吡啶质量浓度; ρ2 为t2 时刻的吡啶浓度。
(9) 分析方法
菌体吸光值的测定: 分光光度法, 仪器为722E 分光光度计。吡啶的检测方法采用高效液相色谱( HPLC) 法[13 ] 。
样品处理: 在好氧降解过程中, 每隔一定时间取样, 水样在8 000 r/ min 下离心10 min , 上清液经0. 45μm 滤膜过滤后用于吡啶的HPLC 定量分析。
色谱仪为岛津LC220A , 色谱柱为大连依利特C18 反向柱, 250 mm ×4. 6 mm , 粒度为5μm ; 流动相为体积分数70 %的甲醇水溶液, 流动相流速为1. 0 mL/ min 测定波长254 nm , 保留时间3. 3 min 。[25]
2.7 生物沸石对吡啶的降解
(1)天然沸石及改性沸石
天然沸石为浙江缙云的斜发沸石,孔隙率为14. 1% ,比表面积为14. 4 m2 / g. 改性沸石为沸石粉、白水泥、沸石砂、淀粉及煤粉按堆体积比为24∶ 6∶ 30∶ 5∶ 3混匀,加入羧甲基纤维素溶液,挤压成型,养护后于650℃ 焙烧2 h 得到,孔隙率为37. 7% ,比表面积为16. 7 m2 / g.
(2)吸附试验
以NH4Cl 配制氨氮溶液,分别称取5. 0 g 的改性沸石和天然沸石置于杯中在恒温振荡培养箱中以30℃,110 r /min 的条件进行吸附试验. 试验设3次重复.
(3) 培养基
吡啶、喹啉降解菌的富集培养采用加入500mg /L吡啶或喹啉的
Luria-Bertani( LB) 培养基[17],降解试验采用含吡啶或喹啉的MSM 液体培养基[1].
(4) 降解菌的富集
本研究所使用的菌株为由焦化废水中筛选出来的1 株吡啶降解菌Shinella zoogloeoides BC026[18]及1 株喹啉降解菌Pseudomonas sp. BW003[19]. 100mL 灭菌的LB 培养基中,加入50 μL 吡啶或喹啉,接种BW003 及BC026 菌株. 30℃,180 r /min的摇床中振荡培养. 将上述处于对数生长期的细菌转入100 mL 离心管在4 200 r /min下离心5 min,将得到的菌体收集并洗涤3 次( 在菌体沉淀中加入约20mL MSM 液体培养基,用Votex 充分悬浮,再离心) ,再转移到一定体积的无菌MSM 液体培养基中,配制成D602为1 ~ 2 的菌悬液,并立即使用. [19]
(5)降解吸附试验
试验分3 组,分别在含270 ~ 310 mg /L吡啶、喹啉的MSM ,MSM + 3. 0 g 天然沸石及MSM + 3. 0 g 改性沸石中进行. 取一定量BC026 及BW003 的菌悬液(D602 = 0. 1) ,分别加入到终体积为100 mL 的上3 种培养基中,封口膜密封,在30℃,180 r /min振荡培养. 定时取样,样品经0. 45 μm 的滤膜过滤后进行吡啶、喹啉及NH +4 -N 的分析测定. 试验进行3 次重复且同时设未加菌的灭菌培养基在同等条件下作为空白对照.
(6)分析方法
吡啶及喹啉浓度通过高效液相色谱( 日本岛津LC10ADVP ,SPD10AVP UV-Vis Detector ,DiamonsilC18 5μm ,250 mm × 4. 6 mm 反向色谱柱) 测定. 进样体积同为10 μL. 其中吡啶浓度是以甲醇∶ 水= 50 ∶50 为流动相,检测波长为254 nm;而喹啉浓度测定是以甲醇∶ 水= 75∶ 25 为流动相,检测波长为275 nm( 高浓度) 及230 nm ( 低浓度) . 流速均为1mL /min. NH +4 -N浓度测定方法为水杨酸-次氯酸盐光度法(GB 7481-87)[20].
(7) 电镜观察
取初始及降解结束后载有生物膜的天然沸石及改性沸石样品,委托中国科学院微生物研究所以扫描电镜( FEI QUANTA 200,荷兰) 进行形态观察. [32]
3 吡啶类化合物的缺氧降解
3.1 含氮杂环化合物吡啶的缺氧降解
(1)废水水质、污泥驯化
试验用水以吡啶为碳源,硝酸钠为氮源,加入必要的营养元素,采用自来水稀释配制。主要营养元素的投加比例为:P :N :Ca :Mg ≈6:28:1:1[5]。本试验选用KH :P04、NaN03、CaCl 。、MgS04作为营养物质。污泥取自上海曲阳污水厂曝气池中的回流污泥。在高100 cm 、直径14 cm 、有效容积为6 L 的反应器里进行驯化。该反应器置于25~28℃的恒温室内,运行方式为间歇式。经过3个多月的驯化,污泥达到稳定性能,其浓度为3.1~3.4 g/L 。
(2) 试验方法
采用摇瓶试验作为主要的研究方法。为了保证相对严格的缺氧条件,采取以下两条措施:1、试验过程中摇瓶用塞密封;2、每个摇瓶只作一次取样,即开启瓶塞一次只取一个水样。经测定,在此条件下,Do 浓度在O .1 mg /L 以下,满足缺氧的要求。同时,保证反应环境始终一致:温度在25℃左右,摇速为180 r/min ,摇瓶中配水的污泥浓度与污泥培养装置中的浓度相同。
(3)水样毒性测定
在25℃下,按照发光细菌法(GB/T15441一1995) 测定水样毒性。本实验选用明亮发光杆菌,购自中国科学院南京土壤研究所;采用DXY 一2型生物毒性测试仪,中国科学院南京土壤研究所研制。首先,在5 mg冻干粉中注入1 mL的3%NaCl ,摇匀,放入置有冰块的小号保温瓶内,2 min后发光细菌复苏发光,放置备用。然后,样品中加入NaCl 使之含量达3%,同时配制3%NaCl 溶液作为对照。分别取对照溶液与测试样品各2 mL 于测试管中,各3个平行,注入10“L 复苏菌液,加塞,用手振摇5次,去塞,放回原位,15 min后测其发光度。水样毒性由相对抑光率表征,相对抑光率越低说明水样毒性越小。[23]
3.2 缺氧反硝化去除难降解杂环化合物吡啶
(1)试验装置
试验装置由3个尺寸相同的反应器组成,高90cm ,直径为14cm ,使用的有效容积为8L ,分别用作好氧,厌氧和缺氧反应器,置于25-28℃的恒温室内,厌氧和缺氧反应器内用搅拌器搅拌,好氧反应器内采用鼓风曝气,用转子流量计调节曝气量控制在0.1m2∕h 左右。
(2)废水水质和污泥驯化
采用人工配水,试验以吡啶为碳源,自来水稀释的原水,同时投加NaNO3作氮源,可根据不同的研究目的改变碳氮比,以研究好氧,厌氧,缺氧条件下吡啶的降解情况及不同的N ∕C 比对吡啶降解效率的影响。
污泥取自曲阳污水厂曝气池回流污泥,经沉淀后的接种污泥浓度约为20g ∕l ,污泥接种量为2.5L ,接种后的污泥浓度为6.25g ∕l, 经过2个月的驯化,达到了稳定的污泥性能和去除效率,为了在相同条件下比较好氧,厌氧,缺氧时吡啶的降解情况,同时控制污泥的浓度在3.5-4.0g ∕l.
(3)试验方法及分析方法
好氧反应器的运行方式为:瞬间进水,曝气,沉淀;厌氧和缺氧翻译器的运行方法为,瞬间进水,搅拌,沉淀。两种方式差异在于缺氧进水中加入大量的NaNO3作为微生物生长所需的N 源,各段的停留时间根据不同的实际情况而定。试验期间各反应器的溶解氧控制为:好氧DO=4-6mg∕l, 厌氧DO=0mg∕l, 缺氧DO=0mg∕l. [15]
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