微生物方法
一、传统方法
参照国标（附：菌落总数、大肠菌群数、单核增生李斯特菌、大肠埃希氏菌O157：H7、 阪崎肠杆菌、 乳酸菌检测国标）
二、 分子生物学方法（PCR 法）
1. 基因组DNA 的分离纯化
在实验过程中，应注意以下条件及要求：①减少化学因素对核酸的降解：避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4-10条件下进行；②减少物理因素对核酸的降解：强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA 分子，对于分子量小的环状质粒DNA ，威胁相对小一些；③防止核酸的生物降解：细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构；DNA 酶需要Mg 2+、Ca2+的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA ，柠檬酸盐，可基本抑制DNA 酶的活性。进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不
能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。
1.1 细菌基因组DNA 提取
直接按照所购DNA 提取试剂的说明操作。
1.2 基因组DNA 的质量检测
0.75%琼脂糖凝胶电泳检测，电压200V ，15min ，在紫外投射仪下观察有无DNA 产物及其质量如何。
1.3 基因组DNA 的浓度测定
可通过紫外分光光度计测定OD 值来估测。纯度测定公式：DNA 纯度=OD260nm /OD280nm 。
1.6-1.8属于正常范围，但也有可能同时混有RNA 和蛋白质；>1.8提示混有RNA ；
2. DNA扩增
2.1 普通PCR
2.1.1 反应条件
2.1.1.1 DNA模板
符合PCR 反应的DNA 模板应该不含有DNA 聚合酶抑制因子，在进行PCR 反应时，模板的数量也是一个重要的因子，一般来说，数量不足的模板将会造成扩增数量减少，而产生假阴性。同时，用于扩增的模板DNA 越多，可以减少由于交叉污染而造成的反应失败。一般50ul 反应体系中，真核生物的DNA 模板数量应25-50ng ，细菌的DNA 模板数量在1-10ng ，质粒在0.1-1ng 。
2.1.1.2 引物
根据不同的研究目的，参考文献选择待扩增片段及设计相关引物，或者找相关公司设计。 设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp ，常用为20bp 左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至10kb 的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。A TGC 最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3' 端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3' 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol 或10～100pmol ，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
2.1.1.3 Mg2+浓度
在PCR 反应体系中，Mg 浓度一般应比dNTP 的总浓度高0.2-2.5mmol/L，大多数情况下选择1.5mmol/L。Mg 可以影响聚合酶的活力和增加双链NDA 的Tm 值。Mg 浓度过低造成聚合酶活力下降，扩增产物降低，产生假阴性；Mg 2+浓度过高，造成非特异性扩增和产生引物二聚体。
2.1.1.4 四种脱氧核糖核酸(dNTP)
在加入dNTP 时，应该使用同样浓度的四种脱氧核糖核酸，通常的PCR 体系中，dNTP 的浓度应在20-200umol/L之间，在此范围内，PCR 的产量、特异性、忠实性之间的平衡最佳。当每种dNTP 浓度为10-50umol/L时，能最大限度地保持PCR 的忠实性。
2.1.1.5 反应缓冲液
一般PCR 反应使用的缓冲液为10倍，在使用时应稀释为1倍。目前常用的缓冲体系为Tris-HCl 缓冲液，通常在缓冲液中加入50mmol/L以内的KCl 以利于引物的退火。
2.1.1.6 耐热DNA 聚合酶
常用的是Taq DNA 聚合酶，在其他参数最佳的时候，每100ul 反应液中加入1-2.5U 的Taq pol为最佳，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
2.1.1.7 标准的PCR 反应体系
2+2+2+
2.1.2 PCR反应条件的优化
因为用PCR 扩增不同的基因，其反应效率和反应忠实性受许多因素的影响，例如，受到不 同生物基因组复杂程度、扩增基因片段在基因组中的拷贝数、核酸提取方法、退火温度、变性温度等多种因素的影响。并且，这些因素之间也是相互影响的。因此，要得到一个PCR 反应效率高，而且反应忠实性高的反应条件，需要综合考虑许多影响PCR 反应的因素。
2.1.2.1 变性
通常解链温度和时间分别为95℃、30s ，有时用97℃、15s 。通常G+C含量约为55%的线性模板DNA 分子的解链温度和时间为94-95℃、45s 。具体条件需摸索。
2.1.2.2退火
合适的退火温度应低于引物Tm 值5℃左右，通常引物与模板的退火温度在45-55℃之间，对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm 值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm 值-(5～10℃)
在Tm 值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR 反应的特异性。另外可采用降式PCR 的方法来确定最佳退火温度。
2.1.2.3 延伸
延伸温度取决于所使用的耐热DNA 聚合酶的最适作用温度，一般为70-75℃. 当使用Taq DNA 聚合酶时，通常延伸温度设定为72℃。
2.1.2.4 循环次数
当待增靶序列数分别为3×10、1.5×10、1×10和50拷贝分子时，最适循环数分别为25-30、30-35、35-40、40-45。一般情况下，循环次数在25-40次之间最适。
2.1.3 PCR产物的检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳（具体操作有管仪器的同学教授）——聚丙烯酰胺凝胶的银染（具体操作有管仪器的同学教授）——阅读序列（看是否有目的片段的扩增）——割胶回收（UNIQ 一10柱式DNA 胶回收试剂盒，有操作说明）——测序公司测序——扩增是否为目的片段
2.2 荧光定量PCR
2.2.1 SYBR荧光染料法
具体操作在所购试剂盒上有标注。 543
2.2.2 Taqman 探针法
一般Taqman 定量PCR 实验过程为：目的基因查找比对——探针与引物设计——探针与引物合成——配置反应体系——反应参数——重复实验，优化条件——获得曲线数据，比对标准曲线——再重复验证
2.2.2.1 目的基因查找比对
在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar 等软件完成目的DNA 或者RNA 的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig （重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA 片段重叠的情况）内。
2.2.2.2 探针与引物设计
2.2.2.2.1 总体原则：
* 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
* 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
* 扩增长度应不超过400bp ，理想的最好能在100-150bp 内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
* 保持GC 含量在20％和80％之间，GC 富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
* 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G （不能有4个连续的G ） * 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
2.2.2.2.2 引物设计原则
* 序列选取应在基因的保守区段
* 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构
* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 * Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC 含量在40%－60%
* 引物之间的TM 相差避免超过2℃
* 引物的3’端避免使用碱基A ，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 * 为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
* Taqman探针技术要求片段长度在50bp －150bp
* 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G 和C 。
2.2.2.2.3 探针设计原则
* 探针位置尽可能地靠近上游引物
* 探针长度应在15-45bp （最好是20-30bp) ，以保证结合特异性
* 检测探针的DNA 折叠和二级结构
* Tm值在65-70℃，通常比引物TM 值高5-10℃（至少要5℃），GC 含量在40%－70%
* 探针的5’端应避免使用G 鸟嘌呤——因为5'G 会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
* 整条探针中，碱基C 的含量要明显高于G 的含量——G 含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
* 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast 中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
2.2.2.3探针与引物合成
寻找一家信赖的公司合成引物和探针，一般引物合成大家比较熟悉，而且价格也比较便宜（特别是这两年便宜了许多），而探针则相对来说贵了许多，一般Taqman 探针合成在1000到5000元不等（不同的合成要求价钱不同）——而这只是标记价钱，序列合成基本上和引物合成价钱相似。
2.2.2.4 参数优化
一般的定量PCR 反应体系与普通PCR 其实也差不了多少，只是要加入Taqman 探针，另外不同就是分步法的不同。其中需要注意的是：
* 扩增酶最好选用热启动酶
* 引物和探针的浓度需要进行优化，建议从50nM 开始，在50nM —900nM 之间优化，一般为200nM （注意探针需要避光保存）。
* Mg 和酶量也需要进行优化，酶的推荐反应浓度是1.25-1.5U （50ul ）
* DNA 模板的添加量通常在100 ng 以下，因不同种类的DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA 模板添加量。如果欲进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR 扩增反应，第一步的RT 反应液作为DNA 模板时的添加量不要超过PCR 反应液总体积的10%。
另外循环参数虽然在引物和探针设计完之后也确定了，但是有时也需要进行优化。
2.2.2.5 标曲
在进行数据分析的时候，通常用不同浓度的标准样品的Ct 值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查PCR 的效率，对于100%PCR效率来说，一个理想的斜率是3.32。最佳的标准曲线是建立在PCR 的扩增效率为90%-100 %(100%意味着在每个循环之后，模板的总数将增加为前一次的2倍) 的基础上。所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R2≥0.99) ，这样才能认为实验的过程和数据是可信的。使用这个方程式我们可以计算出未知样本的初始模板量。大多数定量PCR 仪都有这样一个软件，它可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。这其中有两种基本的方法：绝对定量和相对定量，研究人员需要根据自己的实验目的来选择。绝对定量是指将未知样品与标准曲线相比较进行分析，一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA 样品，要注意得是绝对定量分析的准确性是相对标准品的准确性而言的。相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率，没有确切的数字被检测道。