链霉素发酵的代谢调控育种及研究进展
《现代食品科技》
Modern
FoodscIenceandTechnology
v0I.22No.4(总90)
文章篇号:1007—2764(2006)04一0244—082
链霉素发酵的代谢调控育种及研究进展
耿予欢,李国基,姚汝华
(华南理工大学轻工与食品学院,广东广州5l0640)
摘要:链霉菌在生产抗生素方面的特殊作用使它成为放线茵中遗传育种的核心,近年来的进展主要在于原生质体融合、脂质体的使用,质粒厦其它栽体的发现和克隆技术工业应用。本文综述了链霉素生物夸成途径、代谢调节机制、链霉素发酵的代谢调控育种
厦其进展。
关键词:链霉素;发酵;代谢调控
The
MetabolicControlBreeding粕d
ResearchAdvanceofStreptomycin
FermentatiOn
Geng
Yu—h哪n,LiG帅_jL
YaoRu—hua
(collegeofLightIndustry锄dF00dEngine州ng,SouthchinauniVers时ofTechn0109y'Guangzhou
Abs订act:Special
re∞archeslechnology
510640,china)
functionofg吨ptomycininproducingantibioticsmakcsitt|Ie
core
ofgenetic
brecdi“ginactinomyceces.Therece眦
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This
ont|le
protopl越如sion,the
use
ofIiposome,t|Iediscover
ofplasmid锄dot|1ercarrierandindus砸al8pplicationofclone
aniclereviewsthebiosynt|1esisapproach,mc伯bolicconhDlmech锄ismofs廿eptomycin,metabolicconⅡ州breeding柚d
re辩archadvanceofs吮ptom”infennenti“g.
Keywords:S仃eptOmycin;Femlen协tiOn;Me诅boliccon订ol
链霉素是由链霉胍、链霉糖和N.甲基.L一葡萄糖胺组成的三糖苷,属于氨基糖苷类抗生素。链霉胍是在1,3.位置上带有2个孤基的l,3.去氧青蟹肌醇,
去掉2个脒基后称为链霉胺。链霉糖是带有支链的5’.
NH3
山D.葡萄糖和NH3合成链霉素的大致途径如图1
所示吲。
D.葡萄糖
I
脱氧五碳糖,在第3碳上有1个醛基。N.甲基.L.葡萄糖胺是在第2碳上的-NH2被甲基化(.cH3NH)的L一葡萄糖胺。这三糖连接的糖苷键都是n型的糖苷键。
链霉素发酵工业延续至今已有相当长的历史,和
r墒黼斛专竺嚣麓=j
,
肌醇
N
其它抗生素生产过程一样,它的菌体生长,产物形成等所涉及的一系列时刻变化着的生物化学和质量、能量传递过程【l圳使链霉素发酵表现出相当程度的不确定性。同时又由于反应机理复杂,无合适的模型用以描述过程,使人们在其发酵操作上依赖经验甚于理论。这给链霉素生产水平的提高带来了一定的困难,但同时又给基于理论分析提高生产提供了可能。
1
差向异构化链
_+谷氨酰胺一_+丙氨酸一精氨酸—^
t
=次胺化=次脒基化
链霉胍磷酸酯
、
_+瓜氨酸
/
、
,
j
链霉素生物合成的途径及代谢调节机制
(天冬氨酸)
链j}素磷酸酯
1.1链霉素的生物合成途径
收稿日期,2006_03—16
作者简介:耿予欢.讲师,在职博士。主要从事食品发酵与酿造拄术及海洋生物技术方面的研究开发工作
图1链霉素的生物合成途径
从图l可看出,每生成1个链霉素分子都需消耗
3个葡萄糖分子、7个HN3分子、2个c02分子和l
244
万方数据
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个甲硫氨酸分子。其中,有3个NH3分子是通过转氨基反应,分别把氨基供体——谷氨酰氨、丙氨酸和谷氨酸的氨基结合到链霉胍上和L.葡萄糖胺的氨基上,另外4个NH,分子是通过鸟氨酸环供给的,其中2个分子又由氨甲酰磷酸酯,另外2分子由天冬氨酸引入,最后转变为精氨酸的脒基,再转移到链霉胺衍生物r。2个c02也是通过鸟氨酸循环固定的。
在灰色链霉素的发酵过程中,与链霉素同时产生的还有甘露糖链霉素(链霉素B),其化学结构为N.甲基.L.葡萄糖胺的c。与D.甘露糖的c。以*糖苷键
相连接的糖苷,经过甘露糖苷酶作用,可水解为链霉素和甘露糖。
1.2链霉素生物合成的调节机制
在链霉素生物合成中的调节机制主要有发酵阶
段的转变、分解产物的调节以及无机磷的反馈抑制等方面。
1.2.1发酵阶段的转变
催化链霉胍的2个转脒基反应的酶,在合成阶段开始时的突然出现是由于新的蛋白质的合成,而不是蛋白质的激活。
1.2_2分解代谢产物的调节
在发酵过程中,除形成链霉素外,还形成一种支
路产物——甘露糖链霉素(mmosidosⅡpromyclin,又
叫链霉素B)。对大多数微生物来说,甘露糖链霉素的
生物活性只有链霉素的20%以5%。直到发酵后期才产生水解甘露糖链霉素的*D.甘露糖苷酶,能迅速把甘露糖链霉素水解成链霉素和甘露糖,反应如下:
甘露糖苷酶
链霉素一甘露糖—————>链霉素+甘露糖
1.2.3无机磷的反馈抑制
正常生长所需的无机磷浓度抑制链霉索的形成。
磷酸盐与链霉素的生物合成过程有密切关系,在链霉素生物合成中有几步磷酸酯酶所催化的去磷酸化反应。过量的磷酸盐会产生反馈抑制,阻抑这几步的一个或多个磷酸酯酶的活性或形成,因而抑制链霉索的
合成,因此磷酸酯酶的活力与链霉素的形成有密切关
系。此外磷酸盐还能调节链霉胍合成的关键酶一脒基转移酶的形成,高浓度磷酸盐严重阻遏该酶的形成。
1.2.4碳源、氮源的种类和用量与生物合成的关系
在发酵过程中,碳源是作为链霉菌菌体成分和链
霉素中碳元素来源的重要培养基成分,氮源是构成氨基酸、核酸、蛋白质等菌体胞内物和链霉素的重要营
养来源‘”J,因此发酵罐中这些量的浓度和消耗率变
化趋势能直观地反应出该过程的菌体生长及产物生成
万
方数据的情况。对大多数菌株和大多数培养基来说,葡萄糖是首选碳源,"露糖、麦芽糖、甘油和甘露醇也能维持链霉素的生产,而以淀粉、糊精和果糖作为碳源,则发酵单位4i稳定,蔗糖、戊糖等不能维持菌体牛长。碳源不同,链霉素合成受抑制的无机磷浓度也1i同。
在小蚓碳源中生长的菌丝体的组成也不『司。
2代谢控制发酵育种的基本思想”。
代谢控制发酵(Metab01iccon仃olfeImen诅tion)就是利用遗传学的方法或其它生物化学的方法,人为
地在脱氧核糖核酸(NDA)的分子水平上,改变和控制微生物的代谢,使有用产物火量生成、积累的发酵。
微生物细胞具有高度适应环境和繁殖的能力,这种调节控制作用丰要靠两个因素,即参与调节的有关酶的活性和酶最,也就是反馈抑制和反馈阻遏。代谢调控发酵能否获得成功,目的产物的产量高低与否,关键
在于微生物细胞自我t|封节控制机制是否能够被解除,
能否打破微生物正常的代谢调节,人为地控制微牛物的代谢。
根据代谢控制机制的研究表明,酶的牛物合成受
基因和代谢物的双重控制。
方面,从DNA的分子
水平上阐叫了酶生物合成的控制机制,酶的合成受基因的控制,有基因决定形成酶的分予化学结构;另一方面,从酶学的角度探讨,仪仪有某种基冈,并不能保证大量产乍某种酶。酶的合成还受代谢物(酶反应
的底物、产物及其类似物)的控制和调节。
最有效的方法就足造就从遗传角度解除了微牛
物正常代谢控制机制的突变株。突破微生物的自我调
节控制机制,而使代谢产物大量积累的有效措施如r:
(11应用营养缺陷型菌株。在这些缺陷型黼株巾,由于合成途径中某一步骤发生缺陷,终产物不能积累,
这样就解除了终产物的反馈调节,使之间产物积累或
另1分支途径的末端产物得以积累。
(2)选育抗反馈调节的突变株。由r这样的突变株不再手正常反馈调节作用的影响,使终产物得以积累。
f3)选育细胞膜通透性突变株,以便使终产物在细
胞内不能积累到引起反馈调节的浓度。
(4)利用营养缺陷型凹复突变株或条件突变株的方法,解除终产物对关键酶的调节。
(5)应用遗传工程技术,创造理想的超微生物(即构建目的T程菌株)。
此外,发酵的环境条件,如pH值、NH3的供应、
溶氧水平、营养浓度控制表面活性剂的使用等也都非
常重要。
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3链霉素生产菌的育种思路
根据链霉素生物合成途径及代谢调节机制,选育
链霉素生产菌应从如下几个方面着手
3.1
出发菌株的选择
出发菌株多采用灰色链霉菌(&卸f0啦垆目
肿Pw)、比基尼链霉菌和灰色链霉菌等。灰色链霉菌
的孢子梗直而短,不呈螺旋形,孢子数量很多,孢子乃断裂而成,呈椭圆形,气生菌丝和孢子均呈白色,单菌落生长丰满,呈梅花型或馒头型,直径为3 ̄4mm,基质菌丝透明,在斜面背后产生淡色色素。3.2切断支路代谢
当初级代谢和次级代谢处于分路途径时,通过选
育需要初级代谢产物的营养缺陷菌株可使相应的次级代谢产物增加。据报道,采用诱变的方法获得L.丙氨酸缺陷株,或选育苏氨酸缺陷、芳香族氨基酸缺陷变株,对提高链霉素的产营有一定的作用。
3‘3解除自身的反馈调节
(1)选育抗链霉素突变株:链霉素本身也可能在链霉素合成中起反馈抑制作用,它能够完全抑制链霉胍激酶。通过在培养基中逐步增加链霉素浓度来培养产链霉素的菌株,就可以选出抗性菌株。结合诱变处
理,已获得耐高浓度来培养产链霉素的菌株,就可以
选出抗性菌株。结合诱变处理,已经获得耐高浓度链霉素的菌株,使链霉素的产量得到提高。
(2)选育高浓度磷酸盐抗性突变株:由于高浓度无机磷对链霉素生物合成有抑制作用,因此选育出耐高浓度磷酸盐的新菌种,也是选育高产单位菌种的‘个方向。
通过诱变,可以选育出耐高浓度磷酸盐的突变株,它对磷酸盐的敏感性可能降低。从生产控制来看,
产生抗生素的无机磷需要量为4.5—11.5m∥100恤1,比
菌体生长所需无机磷的量低得多。因此,发酵培养基
种的磷酸盐采用生长的亚适量(suboptimal衙growtfl)
浓度,使菌体生长受到某些控制,菌体代谢活性转为有利于抗生素生物合成的状态。
(3)选育营养缺陷型的回复突变菌:一个突变株
失去某种生化特征,经过2次突变能回复该特征。这
是因为当某一结构基因发生突变后,某一酶就因结构改变而失活,而回复突变可以使其活性中心的结构复
原,但调节部位的结构并未恢复,结果一方面酶恢复了活性,而另一方面反馈抑制却已解除或不怎么严重。
有人通过诱变获得了肌醇缺陷的回复突变株,其链霉
素产量提高了5倍。
万
方数据(4)选育结构类似物抗性突变株:由于某些氨基
酸对链霉素生物合成中的某些酶有阻遏作用,凶此通过选育某螳氨基酸,特别是含硫氨基酸的结构类似物抗性突变株可使链霉素产量提高。据报道,选育乙硫
氨酸、蛋氨酸氧肟酸盐、硒代蛋氨酸、l,2,3.i唑、三氟蛋氨酸抗性突变株,均有助于链霉素产晕的提高。
3.4增加前体物的合成
f】)葡萄糖胺是生物合成链霉素的前体物质。有
人采用诱变方法获得了细胞内葡萄糖胺含量提高3倍
的突变株,其链霉素产量比原菌株提高了‘倍。
(2)精氨酸也是合成链霉素的前体物,增加菌体细胞精氨酸生物合成能力,有利于链霉素产量的提高。
(3)脒基转移酶是链霉胍合成的关键酶。有人将
脒基转移酶进行了兜隆,结果细胞内脒基转移酶的量
得以扩增,从而增加了链霉素的前体物链霉胍的积累,
造成链霉素产量的提高。3.5形态突变株
据报道,挑选洁白、丰满,呈梅花型或馒头型菌
落常是获得链霉素高产菌的条件。若菌落变成光秃型或半光秃型,气生菌丝减少,颜色改变,孢予数量减
少,
‘般说来,其链霉素的产量也大幅度降低。
4链霉菌遗传育种进展”1
链霉菌在生产抗生素方面的特殊作用使它成为
放线菌中遗传育种的核心,近年米的进展主要在于原生质体融合、脂质体的使用、质粒及其它载体的发现
和兜隆技术工业应用。
4.1链霉菌的原生质体融合育种
与细菌相似,链霉菌原生质体制备可使用溶菌
酶,但有些种链霉菌对溶菌酶不敏感,可采用在甘氨酸存在F培养,以改变其敏感性。再生受到多种因素
的影响,培养基巾无机盐要求KH2P04低浓度
(o.005%),c矿、Mf+高浓度(分别为2∞50mmol/L)、
蔗糖lo%~i5%,其它高渗稳定剂(如Nacl)不能取
代蔗糖。细胞的生长期对再生也很重要,处于对数期到平衡期的过渡时期的细胞再生效率最高,而处于对
数中期或平衡期的原生质体很难再生,少量酪蛋白氨
基酸(0.01%)可加速再生过程,链霉菌原生质体不
宜冷贮,贮藏过夜再生能力丧失98%以上。采用原生质体融合获得重组的频率可达3%一30%,与结合相比
高104倍以上。
融合后筛选稳定的重组体时可采用各种方法。比
如利用营养缺陷型作为标记,由两种营养缺陷型菌株经原生质体融合后,在基本商渗平板上筛选。视菌种
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不同出现的原养型茼落可能呈现大小不一的情况,原养型菌制备原生质体后再生所得菌落大小是均匀的,
进行分离分析表明大菌落为真正的重组体,而小菌落
可能为杂核系。原生质体在玻璃纸上完成再生第一阶
段后,再将玻璃纸移到非高渗再生培养基t。利用两
种颜色分辨明显、对原生质体形成和再生无影响的荧
光色素,在原生质体制备时,加入色素达合适的有效浓度,标记后洗去多余染料,融合时在立体显微镜r挑取融合子。利用热或紫外线使原生质体灭活,然后
进行融合,及其它利用形态差异、生化指标等进行选择。
利用原生质体作为DNA受体可以进行转化,此时如没有PEG,则转化频率小于l矿,而PEG的存在可使频率高达14%,此产率在一定范围内正比于DNA
分子浓度,PEG可能作用于细胞膜,使之DNA透性
提高,或使DNA分子够性变化而促进穿透。当外源染色体DNA包裹在脂质体中,然后与原生质体融合
时,则在再生菌落中可发现很高的重组子频率,而且当考察一组紧密连锁的基因时,这些基因相互之间协
同转化的情况是不同的,可能与DNA片断大小有关。
42基因克隆技术在抗生素生产方面的研究
除了基础研究的兴趣以外,链露素及其近缘生物在生物工程学方面特殊的重要性之一是产生抗生素。已知的抗生素的绝大多数是有链霉素产生的。抗生素生产方面利用基因克隆技术有几个特点。通常使用的选择性标记是抗生素生物合成基因或耐药基因。抗生素生物合成受多基因控制,这些基因常常紧密连锁,形成基因簇。对抗生素生物合成的分子遗传学研究的
最重要的进展,就在于阐明了控制每种抗生素生物合
成的基因几乎总是成簇分组排列,不仅包括牛物合成
酶的结构基因,也包括特异的抗性和调节基因。克隆
技术在这方面的研究主要有儿个途径。4.2.1开发新抗生素
通过在产生化学结构类似的抗生素的链霉素之
间进行抗生素生物合成基因的提外转移、不同菌株的
杂交、原生质体融合等都可得到新的抗生素的产生菌。Hopw00d等将天蓝色链霉素中放线紫红素(actiIlorho.din)生物合成的全套基因克隆到榴菌素(F∞actin)和美
达霉素(medernlycin)产生菌中,由于来源丁不同链霉素的基因及其产物之间的相互作用,而抉得新的抗生
素双氢榴紫红素(dihydm舯nact曲odin)和美达紫红素
A(mederI量10dinA),表明有基因工程叮能找到新的抗生素。
4.2.2生物合成基因的克隆
万
方数据将抗生素生物合成基因克隆到受体中并已表达成功。Jones和Hopwood将s.antibiotics的DNA克隆到s.1ivjdans巾,供体菌含有吩嗪合成酶基囚(PHs),该酶参与防线菌素的生物合成,克隆的重组质粒子中
含有1.8,2.4,4.3kb二个插入片段,其中2.4kb含酶结构基因,使受体表达出PHs活性。其它研究报道了。一甲基转移酶基因、异青霉素N合成酶基因(IPs)等的克隆。
4.2.3耐药基因的研究
许多抗牛素产牛茼带有自身耐药基因,如新霉索、链丝霉素、紫霉素、核糖霉素、红霉素等的耐药
基因已经克隆。链丝霉素耐药基因具有特殊的用途,
链丝霉素抗菌力强、作用范围广,但有特殊的延缓毒性,凼而不使用在临床上。利用此基因作为选择标记
可避免选用其它抗性标记可能的环境问题。利用耐药基因克隆也可研究耐药机制,为研究新抗生素起指导作用。
4.3链霉素遗传工程的其它应用
尽管链霉素的生物工程学重要特征是其产生抗生素能力的多样性,但它们生产工业用酶的潜力也不可忽视。链霉素作为葡萄糖异构酶的产生菌已r吁有重
要地位,其它酶类如蛋白酶、纤维素酶、木质素酶、
木聚糖酶、淀粉酶、角蛋白酶等也将逐步占据熏要地位,Ji:且利用重组DNA技术来提高生产这种酶的能jj具备巨天锑】港●j。
遗传工程技术问世以来,克隆外源基冈,尤其是
真核生物的基网大多使用大肠杆菌寄牛系统。然而大
肠杆菌系统的不足之处足蚩白质产物不易外泌,人们
尝试利用枯草杆茼及酵母作为寄主系统,但它们很强
的胞外蛋白酶活性有给外泌异源基因的蛋白产物造成不利影响。因此,人们逐渐注意开发和理应链霉素作
为遗传工程上表达和分泌异源基因产物的重要的寄丰
系统。许多研究表明,牛生长激素基因、人类白细胞
介素、人类干扰素IFN.a1、IFN.以及人类肿痛坏死因子基冈等,已可利用基因重组技术引入链霉素r},并得以表达。链霉素可作为替代寄主来生产哺乳动物蛋自,
如胰岛素、干扰素、白细胞介素或者重组疫苗等。链霉素中致病菌极少,用作基因工厂受体比较安全,这
是将链霉素发展为有价值的遗传工程菌系统的有利条件,可望它在低成本、大规模生产各种蛋白(包括酶)
方面起到特殊作用。参考文献
(下转第231页)
!堡垡!曼壁垫!——Mode’坚Food
衰I三种南瓜子油各膳肪醚相对含量
sclenceand
Technology、,01.22No.4(总如)
3.2
南瓜子是否加工对南瓜子内脂肪酸的影响
hb.1
ThenI_dvec蛐tent
offatty删dhum
thr神pumpkiIlseedo豇由表1可看出,经过加工的茶瓜子在脂肪酸种类
E与两种未经加工的瓜子在品种上有差别,而且含最
脂肪酸
恰恰茶瓜子板栗南瓜子传统南瓜子
相差较大,其中9c,12c.18:2在加工的茶瓜子和未经加
工巾板栗南瓜子、传统南瓜子中的含量分别是1.05、
29.72、23.03。
3.3南瓜子油中含大量不饱和酸
其中普通南瓜子油含量达80.56%,板栗南瓜子油
的含量也达到71.07%,经加工的茶瓜子为55.52%。值得注意的是经加工的南瓜子18:O和16:0含量明显升高。
3.4南瓜子油含少量的共轭亚油酸和花生四烯酸
南瓜子加工与否均含有‘定的共轭Ⅱ油酸和花生
四烯酸,共轭亚汕酸作为一种新型的脂肪酸,其生理功能已逐渐为人们所认同,抗癌、抗动脉粥样硬化,
提高免疫系统机能,减少脂肪沉积等。其中9c。11t.18:2具有降低胆固醇、促进牛挺发育、抗氧化等功效,而花生四烯酸作为人体必需脂肪酸对大脑的生长发育具有非常重要的作用。因此,南瓜子油在人体保健发挥着重要的作用。参考文献
8
l
心立S
L~-6、
¨-…ph.n…d。
i
[1]嗣代华实用中药辞典[下卷】北京:人民卫生出版社,2002,
l
32l~1323
f2]吴围欣,李永星,陈密玉等.南瓜子的研究进展.海峡药学,
2003.15:ll~13
[3]
N
seh鸸MPYuraw∞毛JAGRo∞h,cta1.silvepionhi曲
ljquid
p州b丌TI鲫ce
c蛔ma幻gmphic
sepa坩石on锄d
idend争
cationofconj“gacedlinoleicacidisomersⅣ】.Lipids,1998,33:
217.221
[4]
图2南瓜子中共轭亚油酸图谱
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JohnAGRoachMagdiMMossoba’M
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226
P咖YumwecZ,etal_
identincationofconjugated
chmmato矿岫sofconju霉nted曲okic
linoleicacidisomers[刀Anal”icachimicaActa,2002,465:207—
acIds岫pumpⅪnseeds
(上接第247页)[1]
1992:245
徐浩工业微物生学基础及其应用,北京:科学出版社,
199l:345
【5】
山根恒夫著,周斌译.生化反应T程.两安:西北大学}}j版
社.1992:163
【2】
Bailey
JE.0UisDFBiochemical
Engineenng【6】张克旭,陈宁等编.代谢调控发酵.北京:中国轻工、№出版社,1998
F啊danlent甜s.2州.N洲Yofk:McGrawHillh..1986:459
[3】
徐亲民主编.抗牛素工艺学.北京:中国建材工业出版社,
1994:79
【7】陶文沂主编工业微生物生理与遗传育种学北京:中国轻工业出版社.1997
【4】俞俊棠,唐孝宣.生物工艺学.上海:华东化工学院出版社,
万方数据