微生物限度检查法

微生物限度检查法

细菌及控制菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃。

检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。

检验量

检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。

除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g或10ml用于阳性对照试验)。

检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。

一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。

供试液的制备

根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

常用的供试液制备方法如下。

1．液体供试品

取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

2．固体、半固体或黏稠性供试品

取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

阴性（-）对照试验 取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。

阳性（+）对照试验 阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查，对照菌（检测的控制菌）的加菌量为10～100cfu（加对应控制菌制成的溶液1ml）。阳性对照试验应检出相应的控制菌。

培养和计数 除另有规定外，细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。

一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。（30-300cfu）

薄膜过滤法

取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g、1ml或10cm2所含的菌数较多时，可取适宜稀释级（10-1）的供试液1ml进行试验。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液（蛋白胨缓冲液）冲洗滤膜。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。

细菌、霉菌及酵母菌检验：

需8个培养皿，共两个稀释级别：10-1的培养皿，细菌、霉菌各两个，共四个。10-2的培养皿，细菌、霉菌各两个，共四个。

10-1级：各取供试品液1ml，分别加入4个培养皿中。细菌培养皿加入营养琼脂培养基，并加入TTC（加入比例，100ml营养琼脂培养基加入0.1mlTTC）指示剂，使细菌显红色，然后放入培养箱培养3天。霉菌及酵母菌培养皿加入玫瑰红钠琼脂培养基，然后放入培养箱培养5天。最后计数，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2,供试品中所含的菌数。

10-2级：取供试品液1ml，加9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液混合为10ml溶液，从上述10ml混合液中各取1ml，分别加入4个培养皿中。细菌培养皿加入营养琼脂培养基，并加入TTC（加入比例，100ml营养琼脂培养基加入0.1mlTTC）指示剂，使细菌显红色，然后放入培养箱培养3天。霉菌及酵母菌培养皿加入玫瑰红钠琼脂培养基，然后放入培养箱培养5天。最后计数，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2,供试品中所含的菌数。

控制菌检查

控制菌检查用培养基的适用性检查

控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。

菌种 对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。

大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B) 44 102〕

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕

乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC (B) 50 094〕

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruglnosa)〔CMCC(B) 10 104〕

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕（第四代接种菌里未涉及） 白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕

接种：

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上。培养24～48小时。

接种白色念珠菌（真菌）的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养24～48小时。

接种黑曲霉（真菌）的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5～7天，加入3～5ml含0.05％(ml／ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％(ml／ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

计数：

取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；

取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个乎皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数；

取白色念珠菌50～100cfu，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液，其配置方法一般： 大肠埃希菌：取0.1ml大肠埃希菌接种培养液，放入100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10

-3-6-3级溶液；取0.1ml10级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10级溶液；取6ml10

级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10级溶液，即得最终需要的溶液。 -7-6

金黄色葡萄球菌：取0.1ml金黄色葡萄球菌接种培养液，放入100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10级溶液；取0.1ml10级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10级溶液；取8ml10级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10级溶液，即得最终需要的溶液。 乙型副伤寒沙门菌：取0.1ml乙型副伤寒沙门菌接种培养液，放入100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10级溶液；取0.1ml10级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10级溶液；取5ml10级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10级溶液，即得最终需要的溶液。

铜绿假单胞菌：取0.1ml铜绿假单胞菌接种培养液，放入100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10级溶液；取0.1ml10级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10级溶液；取4ml10级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10级溶液，即得最终需要的溶液。 白色念珠菌：取0.1ml白色念珠菌接种培养液，放入100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10

-3-5-3-6-7-3-3-6-6-7-3-3-6-6-7-3-3-6级溶液；取1ml10级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10级溶液，即得最终需

要的溶液。

大肠菌群的检验：

取含适量(不少于10ml)的乳糖胆盐发酵培养基试管3支。分别加入

1：10（10g或10ml供试品溶于100ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）的供试液1ml(含供试品0.18或0.1ml)、

1：100（1ml上述1：10的溶液加9ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）的供试液1ml(含供试品 0.01g或0.01ml)、

1：1000（1ml上述1：10的溶液加9ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）的供试液0.1ml(含供试品0.001g或0.001ml)，

另取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液（pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）1ml作为阴性对照管。培养18～24小时。

结论：若产酸产气，判该乳糖胆盐发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。 大肠埃希菌的检验：

取（用10g或10ml供试品与pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成的100ml溶液）供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2)，直接或处理后接种（加入）至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基锥形瓶中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。

取上述培养物0.2ml，接种至含5ml MUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液（2-3滴），液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。

如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

若平板上无菌落生长或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验，确认是否为大肠埃希菌。

表3 大肠埃希菌菌落形态特征

乙型副伤寒沙门菌的检验：

直接取供试品10g或10ml，直接或处理后接种（加入）至适量(不少于200m1)的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养18～24小时。

取上述培养物1ml，接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）中（另加4滴碘液和2滴铜绿溶液），培养18～24小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂)

培养基和麦康凯琼脂(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基的平板上，培养18～24小时(必要时延长至40～48小时)。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表6所列的特征，判供试品未检出沙门菌。

若平板上生长的菌落与表6所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2～3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的鉴定试验，确认是否为沙门菌。

表6 沙门菌菌落形态特征

稀释液

稀释液配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

1．pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 照无菌检查法(附录ⅩⅢ B)制备。

2．pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液 按缓冲液(附录ⅩⅤ D)配制后，过滤，分装，灭菌。

如需要，可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

3．0.9％无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。 1．0.1％蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH值至

7.1±0.2，分装，灭菌。

2．pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 取磷酸二氢钾3.56g、 磷酸氢二钠7．23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解。滤清，分装，灭菌。

微生物限度标准

非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及中药

的特殊性而制订的。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，中药提取物及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。

1．制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂 应符合无菌检查法规定。

2．口服给药制剂

2.1 不含药材原粉的制剂

细菌数 每1g不得过1000cfu。每1ml不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g或1ml不得过100cfu。

大肠埃希菌 每1g或1ml不得检出。

2.2 含药材原粉的制剂

细菌数 每1g不得过10 000cfu(丸剂每1g不得过30 000cfu)。每1ml不得过500cfu。 霉菌和酵母菌数 每1g或1ml不得过100cfu。

大肠埃希菌 每1g或1ml不得检出。

大肠菌群 每1g应小于100个。每1ml应小于10个。

2.3 含豆豉、神曲等发酵原粉的制剂

细菌数 每1g不得过100 000cfu。每1ml不得过1000cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g不得过500cfu。每1ml不得过100cfu。

大肠埃希菌 每1g或1ml不得检出。

大肠菌群 每1g应小于100个。每1ml应小于10个。

3．局部给药制剂

3.1 用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂 应符合无菌检查法规定。

细菌数 每1g或10cm2不得过1000cfu。每1ml不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm2不得检出。

3.3 用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂

细菌数 每1g或10cm2不得过10 000cfu。每1ml不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm2不得检出。

3.4 耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂

细菌数 每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2不得过10cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm2不得检出。

大肠埃希菌 鼻及呼吸道给药的制剂，每1g、1ml或10cm2不得检出。

3.5 阴道、尿道给药制剂

细菌数 每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2应小于10cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌、白色念珠菌 每1g、1ml或10cm2不得检出。

3.6 直肠给药制剂

细菌数 每1g不得过1000cfu。每1ml不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g或1ml不得过100cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每1g或1ml不得检出。

3.7 其他局部给药制剂

细菌数 每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm2不得检出。

4．含动物组织(包括脏器提取物)及动物类原药材粉(蜂蜜、王浆、动物角、阿胶除外)的口服给药制剂 每10g或10ml还不得检出沙门菌。

5．有兼用途径的制剂 应符合各给药途径的标准。

6．霉变、长螨者 以不合格论。

7．中药提取物及辅料 参照相应制剂的微生物限度标准执行。