大鼠脂多糖结合蛋白(LBP)ELISA试剂盒说明书

大鼠脂多糖结合蛋白(LBP)酶联免疫分析（ELISA ）

试剂盒使用说明书

厦门慧嘉生物科技有限公司

本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中脂多糖结合蛋白(LBP)含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠脂多糖结合蛋白(LBP)水平。用纯化的大鼠脂多糖结合蛋白(LBP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入脂多糖结合蛋白(LBP)，再与HRP 标记的脂多糖结合蛋白(LBP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的脂多糖结合蛋白(LBP)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中大鼠脂多糖结合蛋白(LBP)浓度。

样本处理及要求：

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA 、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中

如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS （PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS ，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS （PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 操作步骤

1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标

准品100μl ，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl ，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl ，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 弃掉，再各取50μl 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul ，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl ，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl ，混匀后从第九第十孔中各取50μl 弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl ，浓度分别为12 ng/ml，8 ng/ml ，4 ng/ml，2 ng/ml，1 ng/ml）。

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样

品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl ，然后再加待测样品10μl （样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4. 配液：将30（48T 的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T 的20倍）倍稀释后备用。 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此

重复5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl ，空白孔除外。 7. 温育：操作同3。 8. 洗涤：操作同5。

9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl ，再加入显色剂B50μl ，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

15分钟.

10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止

液后15分钟以内进行。 注意事项：

1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未

用完，板条应装入密封袋中保存。

2． 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好

控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD 值

大于标准品孔第一孔的OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n ×5）。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6． 底物请避光保存。

7． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8． 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9． 本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。 计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标， 在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释 倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值 代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际浓度。

试剂盒性能：

1. 样品线性回归与预期浓度相关系数R 值为0.95以上。 2. 批内与批见应分别小于9%和11%

检测范围： 0.3 ng/ml - 16 ng/ml

保存条件及有效期： 1. 试剂盒保存：；2-8℃。 2．有效期：6个月