Fenton反应产生的羟基自由基及其清除的分光光度法测定
第2卷第1期2007年2月北京教育学院学报(自然科学版)
JOURNALOFBEIJINGINSTTTUTEOFEDUCATION(NATURALSCIENCE)Vol.2No.1Feb.2007
Fenton反应产生的羟基自由基及其清除的
分光光度法测定*
宋艳1**
邹洪1
董瑞2
(1.首都师范大学化学系北京,100037;2.广州冷机股份有限公司,广州,510470)
摘要:Fenton反应产生的羟基自由基氧化二甲亚砜MSO)生成的甲醛与2,4-二硝基苯肼(D
NPH(D)反应在碱性条件下生成稳定的酒红色腙类物质,其最大吸收波长为390nm,光度法测
该方法简便可靠,拟定的方法测定了数种清除剂的IC50。定其含量可间接测定OH的生成量。・可用于羟基自由基清除剂的筛选.
关键词:羟基自由基;清除剂;2,4-二硝基苯肼;分光光度法中图分类号:O657・32
文献标识码:A
文章编号:CN11-5340/N(2007)01-0001-02
羟基自由基是造成脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的重要活性氧自由基[1]。由于・反应活性大,存在浓度低,测定时存在一定OH
难度。目前测定OH・的方法主要有电子自旋共振(ESR)[2]、高效液相色谱(HPLC)[3]、化学发光法[4]
近年来DMSO作为OH的探针试剂逐渐引起。・
本文采用Fenton体系产生OH了人们的关注[5]。・
与二甲亚砜(DMSO)反应产生甲醛,再与2,4-二硝基苯肼(DNPH)反应生成相应的腙(HCHO-DNPH),光度法测定,通过对测定条件的研究,得到了最佳的实验方案并成功地用于羟基自由基清除剂的筛选。
1.2实验方法
1.2.1羟基自由基的产生在10mL的反应溶液中,含pH5.9KH2PO4-Na2HPO4(0.067mol/L)2mL,DMSO(1.0mmol/L),Fe2+-EDTA(0.9mmol/L),H2O2(2.0mmol/L),混合溶液于37℃水浴反应15min。
1.2.2羟基自由基的测定在上述溶液中加入0.5mLDNPH于60℃水浴反应20min,取出后流水冷却,再加入2mLKOH,溶液最终pH为11.8,摇匀,于390nm测定吸光值。
2结果与讨论
1实验部分
1.1仪器与试剂
TU(1810PC紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器公司),pH-2C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。Fe2+-EDTA(摩尔比1:1):0.03mol/L;DMSO:0.01mol/L;H2O2:0.10mol/L;pH5.9的KH2PO4-Na2HPO4缓冲液:0.067mol/L;KOH:10%;2,4-二硝基苯肼:0.03mol/L,每天新配制;
所用试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水。
2.1紫外可见吸收光谱图(图1)
2,4-二硝基苯肼本身显黄色,其最大吸收在270nm,于200-600nm范围内扫描,获得吸收光谱曲线。曲线表明,反应液有2个吸收峰,390nm处的吸收峰较270nm处的平缓,且2,4-二硝基苯肼自身在390nm处的吸光度很小,所以选择390nm作为测定波长。
2.2pH的影响pH在5 ̄13之间,吸光度随pH升高逐渐增大,当pH为11.8时吸光度达到最大,之后趋于
*收稿日期:2007-01-18
**作者简介:宋艳(1981-),女,山东淄博市人,首都师范大学化学系硕士研究生。
1
北京教育学院学报(自然科学版)
当DMSO用量大于0.6mmol/L时,吸光度达到最大且稳定。因此实验选择DMSO用量为
1mL,即1.0mmol/L。
2.6DMSO降解时间影响
实验结果表明,DMSO降解时间为10 ̄25min时,吸光度达到最大且基本稳定,实验选
图1吸收光谱图
择15min。
1DMSO+Fe2+-EDTA+H2O2+DNPH;2DMSO+Fe2+-EDTA+H2O2+DNPH+antioxidant;3DNPH
2.7DNPH用量影响
改变DNPH的用量,结果表明,当DNPH的
用量大于0.5mL时,吸光度达到最大且基本稳定。实验选择DNPH浓度为1.5mmol/L。
平稳。选择pH为11.8。
2.3Fe2+-EDTA用量影响(图2)
改变Fe2+-EDTA(1:1)的用量进行测定,当Fe2+-EDTA用量大于0.3mL时,吸光度最大且基
本稳定,本实验选择0.3mL,浓度为0.9mmol/L。
2.8方法的准确性与精密度
当没有清除剂存在时,按实验方法,对于
1.0mmol/LDMSO,5次测定的吸光度(A)为:1.853,1.841,1.854,1.849,1.860,RSD为0.38%。
可见,本法具有良好的准确性与重现性。
的清除作用・2.9清除剂对OH
清除剂清除羟基自由基IC50的求算:在
1.2.1体系中加入一定量的清除剂,按1.2.2的方
法测定吸光度A,按下式计算:清除率=(A0-As)/A0×100%,A0为未加清除剂时的吸光度,As为清
图2Fe2+-EDTA浓度的影响
除剂存在时的吸光度,以清除率对清除剂浓度作图,得到清除剂的IC50,如表1所示。
表1:羟基自由基清除剂的IC50
DMSO:1mmol/LH2O2:2mmol/LDNPH:1.5mmol/L
pH:11.8
ScavengerMannitolThioureaL-ArginineL-CysteinL-TryptophaneL-Histidine
参考文献:
IC50(mmol/L)
Thismethod16.671.463.681.041.211.08
Valuesinreference
2.90[6]0.19[6]1.20[6]0.16[6]0.24[6]0.17[6]
2.4H2O2用量影响(图3)
Fenton体系自身可以产生H2O2,但额外H2O2的加入可以提高自由基的产生量。实验结果表明,H2O2的浓度达到1mmol/L时,吸光度最大且趋于平稳,实验选择2mmol/L。
[1]FrederickVL.Freeradicals[J].ClinicalChemistry,1993,65(12):374-377
[2]KeizoT,KaoriF,KazunoriA,ToshihikoO.InvivomonitoringofhydroxylradicalgenerationcausedbyX-rayirradiationofratsusingthespintrapping/EPRtechnique
图3H2O2浓度的影响
[J].FreeRadicalbiomed,2004,36(9):1134-1143
[3]ChaoTai,Jin-FengPeng,Jing-FuLiuetal.Determinationofhydroxylradicalsinadvancedoxidationprocesseswithdimethylsulfoxidetrappqingandliquidchromatography[J].AnalChimActa,2004,527:73-80
DMSO:1mmol/LFe2+-EDTA:0.9mmol/LDNPH:1.5mmol/L
pH:11.8
2.5DMSO用量影响2
(下转第25页)
申雯:焦点解决短期心理咨询概述
本理念与比较优势[J].承德石油高等专科学校学报,[7]陈建波.焦点解决:学校心理咨询新视角[J].教育导刊,2005,3:25-29.
[8]王玲.焦点解决短期心理咨询在学校咨询中的应用.健康心理学杂志,2002,5:344-345.
[9]缪爱国.一种新的方法:焦点解决短期咨询[J].班主任之友,2005,5:38-39.
[10]沈之菲.让心理咨询更有效
——焦点解决短期心理疗法探究.思想理论教育[J].—
2005,2:63-65.
[2]刘宣文,何伟强.焦点解决短期心理咨询原理与技术述评[J].心理与行为研究,2004,2(2):451-455.
[3]方建移,刘宣文,等.心理咨询新模式:聚焦于问题解决的短期咨询[J].心理科学,2006,29(2):430-432.
[4]杨波,刘宣文,等.焦点解决短期咨询与学校心理社会科学版),2005,3:136-140.辅导[J].重庆大学学报〔
[5]黄耀辉译.儿童与青少年焦点解决短期心理咨询[M].四川:四川大学出版社,2005.
[6]琚晓燕,刘宣文.焦点解决短期咨询在学校辅导中的应用[J].中小学心理健康教育,2004,1:35-37.
2005,6:57-60.
[11]王玲.焦点解决短期心理咨询法的评介[J].中国心理卫生杂志,2002,10:675-676.
AStudyOnSolution-FocusedBriefCounseling
ShenWen
(DepartmentofEducation,HunanNormalUniversity,Changsha410081,China)
Abstract:Solution-focusedbriefcounselingisanewmode,gainingitspopularitywithin
psychologicalservicesacrosstheworldandwidelyusedindifferentcircumstancesforitsmanyadvantages,suchaspositivethinking,time-andlabor-saving.Thispaperintroducesitsbackground,exploresitsbasicthought,pointsoutitsappliedfields,andgivesasimpleassessmentofit.
Keywords:Solution-focusedbriefcounseling;briefcounseling;psychologicalcounseling
(责任编辑
何艳)
(上接第2页)
[4]Choiwan
L,
Jianzhong
L,
Masaaki
K.
Chemiluminescencedeterminationoftetracyclinebasedonradicalproductioninabasicacetonitrile-hydrogenperoxidereaction[J].AnalChimActa,2004,503:235-239
[5]FukuiS,HanasakiY,OgawaS.High-performance
liquidchromatographicdeterminationofmethanesulphinicacidasamethodforthedeterminationofhydroxylradicals[J].Chromatogr,1993,630(1-2):187-193
[6]邰超,邹洪,等.Fenton反应产生的羟基自由基及
其清除的电化学方法测定[J].分析测试学报,2002,21(5):
30-32
DeterminationofHydroxylRadicalandItsScavengingbySpectrophotometryMethodSongYan1,ZouHong1,DongRui2
(1,DepartmentofChemistry,CapitalNormalUniversity,Beijing100037,China;2,GuangzhouRefrigerationComporationLimited,GuangZhuo510470,China)
Abstract:Anewspectrophotometrymethodfordeterminationofhydroxylradicalwasproposed.Hydroxylradicals,generatedbyFentonreaction,attacksdimethylsulfoxidetoformformaldehyde,whichthenreactswith2,4-dinitrophenylhydrazinetoformstableredhydrazinethatexhibitsanabsorptionmaximumat390nm.Thequantitativeanalysisofhydroxylradicalcanbedonethroughthedeterminationoftheabsorption.Thismethodissimpleandcanbeemployedfortheresearchingofthehydroxylradicalscavengers.
Keywords:hydroxylradical;scavenger;2,4-Dinitrophenylhydrazine;spectrophotometry
(责任编辑
何艳)
25